自2022年5月《新污染物治理行動方案》發(fā)布以來，我國新污染物治理步入“快車道”。新污染物，主要包含持久性有機污染物、內(nèi)分泌干擾物、抗生素、微塑料四大類，具有生物毒性、環(huán)境持久性、生物累積性等特征，對生態(tài)環(huán)境或者人體健康存在較大風險，甚至會引起廣泛的毒理學和生物學效應，包括發(fā)育毒性、內(nèi)分泌干擾、免疫毒性、致癌性和生殖受損等。
近年來，斑馬魚作為國際公認的毒理學研究模型，其與人類基因同源性高達87%，對有毒有害物質(zhì)非常敏感，并具有周期短、高通量、毒性評價指標多樣化等獨特優(yōu)勢，被廣泛應用于毒性檢測、分子及細胞生態(tài)毒理研究、生物誘導效應檢測及新污染物毒性評價等方面。
01、斑馬魚在新污染物領(lǐng)域的研究方向
當前，隨著大規(guī)模工業(yè)發(fā)展和人類活動的增加，全球環(huán)境污染問題日益嚴重。其中，新污染物在環(huán)境中主要以痕量/超痕量的形式存在，僅靠化學檢測方法無法有效評估污染物復合暴露產(chǎn)生的環(huán)境風險，因此，如何選擇高靈敏度、高特異性的檢測方法，識別新污染物的毒性效應，評估潛在環(huán)境風險，一直是新污染物治理面臨的重要挑戰(zhàn)。
通過構(gòu)建斑馬魚胚胎毒性、急性毒性、神經(jīng)毒性、生殖毒性、子一代生殖毒性、雌激素快篩、氧化應激、炎癥模型等，來研究新污染物的生物毒性、器官富集和器官毒性，單種、多種新污染物的生物毒性、復合毒性及機制、毒性緩解措施，快速定性定量篩查樣品中的雌激素，并應用于環(huán)境風險篩查和評估，為新污染物的評價提供了方便、有效的方法。
研究新污染物的生物毒性、器官富集和器官毒性
胚胎毒性、急性毒性等毒性模型可用于研究新污染物的毒性情況和毒性靶器官。由于斑馬魚胚胎對外界毒性敏感，能迅速反應樣品的毒性情況，從而判斷樣品的的毒性情況。
在利用斑馬魚胚胎評價環(huán)境新污染物的生物毒性及器官毒性時，通過觀測經(jīng)毒性物質(zhì)染毒條件下魚卵胚胎心跳的情況，可以判斷魚卵胚胎發(fā)育的毒性效應；通過觀察斑馬魚器官畸形、突變及死亡情況等，也可以評估樣品的毒性情況。
研究單種新污染物的生物毒性及機制
通過單種新污染物給藥，結(jié)合毒性模型和凋亡細胞、切片、基因、蛋白等檢測手段，對新污染物的生物毒性機制進行研究。
在利用斑馬魚進行凋亡細胞檢測時，對斑馬魚身體各部分凋亡細胞進行熒光染色，通過低熒光強度的定量判定斑馬魚各器官凋亡細胞情況，從而判定新污染的毒性和靶器官；在利用斑馬魚進行器官組織變化觀察時，對斑馬魚組織切片，通過閱片判定斑馬魚器官組織的變化，從而判定新污染的毒性和靶器官；利用分子通路研究時，通過代謝組學分析新污染物暴露后斑馬魚體內(nèi)蛋白的變化，從而判斷毒性機制。
研究多種新污染物的復合生物毒性及機制
通過多種新污染物復合給藥，結(jié)合毒性模型和凋亡細胞、切片、基因、蛋白等檢測手段，對新污染物的復合生物毒性機制進行研究。
通過對斑馬魚的行為分析，評估樣品的神經(jīng)毒性，判斷新污染的毒性機制；參考OECD，通過檢測斑馬魚性腺切片、性激素水平、基因表達水平判斷樣品的生殖毒性，評估新污染物的毒性機制；參考ZEOGRT，通過子一代的孵化、死亡情況，器官畸形情況的檢測，評估樣品的子一代生殖毒性，判斷新污染物的毒性機制；通過熒光染色斑馬魚體內(nèi)自由基（ROS），評價斑馬魚的氧化應激水平。
快速定性定量篩查樣品中的雌激素
通過雌激素快篩模型可快速篩查樣品中雌激素的情況。當雌激素熒光斑馬魚暴露在有雌激素的樣品中時，斑馬魚肝臟部位會產(chǎn)生綠色熒光，通過熒光的強弱可以反映產(chǎn)品中雌激素含量，從而快速篩查樣品中雌激素的情況。下圖為雌激素處理后斑馬魚熒光表型圖——
通過克隆斑馬魚雌激素響應元件ERE的DNA序列，并在胚胎顯微下注射構(gòu)建的質(zhì)粒Tol25×EREGFF，通過Founder篩選培養(yǎng)得到轉(zhuǎn)基因雌激素綠色熒光斑馬魚Tg(5×ERE:GFF;UAS:EGFP)。所得轉(zhuǎn)基因斑馬魚，在雌激素刺激下，5×ERE響應，激活GFF的表達，而GFF蛋白可與UAS結(jié)合，進而驅(qū)動綠色熒光蛋白（EGFP）的表達，從而達到方便、直觀、動態(tài)檢測環(huán)境雌激素是否存在及其濃度的目的。
研究新污染物的毒性緩解措施
通過緩解劑和新污染物同時給藥，采用毒性模型和凋亡細胞、切片、基因、蛋白等檢測手段，對緩解劑的效果進行研究。通過中性粒細胞熒光魚、巨噬細胞熒光魚的聚集情況，檢測斑馬魚體內(nèi)炎癥相關(guān)基因的表達水平，評價斑馬魚的炎癥水平。
02、斑馬魚在新污染物的應用進展
當前，持久性有機污染物、內(nèi)分泌干擾物、抗生素、微塑料是環(huán)境中普遍存在的新污染物，由于其大量應用于人類生產(chǎn)和生活中，并通過機體代謝排放，已經(jīng)對環(huán)境造成持續(xù)的污染。
近年來，利用斑馬魚開展對新污染物毒性評價及生物健康效應的研究，對保護環(huán)境及促進生命健康發(fā)展具有重要意義，為有效解決和控制新污染物提供了越來越多的理論支撐。環(huán)特生物依托于10多年的基因編輯及斑馬魚技術(shù)服務(wù)經(jīng)驗，致力于為客戶構(gòu)建斑馬魚新污染物毒性評價模型，涵蓋斑馬魚胚胎毒性、急性毒性、神經(jīng)毒性、生殖毒性、子一代生殖毒性、雌激素快篩、氧化應激、炎癥模型等百余種常見斑馬魚模型，服務(wù)客戶數(shù)量超過20000家，讓新污染物科學研究事半功倍。斑馬魚在新污染物的國際前沿應用進展如下——
斑馬魚在持久性污染物上的應用
全氟丁烷磺酸(PFOS)是一種新型的持久性有機污染物，對魚類甲狀腺內(nèi)分泌系統(tǒng)具有一定的損害效應，并可以干擾魚類腸道菌群組成，導致脂質(zhì)代謝障礙等。目前，全世界范圍內(nèi)被調(diào)查的水體、沉積物和生物體內(nèi)都檢測出存在PFOS 等全氟類化合物污染的蹤跡。
研究對象：全氟丁烷磺酸與益生菌對斑馬魚甲狀腺內(nèi)分泌系統(tǒng)的聯(lián)合效應研究
益生菌能在一定程度上減輕環(huán)境污染物對生物體造成的危害，但其能否調(diào)節(jié)PFBS的甲狀腺內(nèi)分泌干擾效應尚不清楚。研究中，通過將成年斑馬魚暴露于不同質(zhì)量濃度（0、10和100μg/L）PFBS的養(yǎng)殖水中28d，投喂添加或不添加益生菌（鼠李糖乳桿菌）的飼料，測定親代下丘腦-垂體-甲狀腺軸關(guān)鍵基因，以及親代大腦、血液和子代胚胎中甲狀腺激素水平，以探究PFBS與益生菌共暴露對斑馬魚甲狀腺內(nèi)分泌系統(tǒng)的聯(lián)合效應。
結(jié)果顯示，在激素水平上，PFBS降低了親代血液T3水平，而添加益生菌能減輕雄魚血液T3水平的降低；在基因水平上，100μg/L PFBS與益生菌共暴露促進雄魚大腦tshβ基因表達以應對低水平的T3，并與相應PFBS單獨暴露相比差異顯著，表明添加益生菌可以減輕高質(zhì)量濃度PFBS誘導的雄魚大腦T3水平的降低；PFBS單獨暴露能上調(diào)雌魚大腦trα基因表達，而PFBS與益生菌共暴露則上調(diào)trα和trβ基因表達，表明添加益生菌能使機體積極地應對PFBS誘導的雌魚大腦T3水平降低。
研究發(fā)現(xiàn)PFBS單獨暴露能引起斑馬魚的甲狀腺內(nèi)分泌系統(tǒng)紊亂，而PFBS與益生菌共暴露后，益生菌能在一定程度上通過甲狀腺激素水平和基因表達調(diào)節(jié)PFBS的毒性效應，為后續(xù)PFBS毒性效應的研究及毒性緩解措施的開發(fā)提供了重要參考。
來源：全氟丁烷磺酸與益生菌對斑馬魚甲狀腺內(nèi)分泌系統(tǒng)的聯(lián)合效應研究
斑馬魚在內(nèi)分泌干擾物上的應用
環(huán)境內(nèi)分泌干擾物 (EDC) 是一種外源性持久性有機污染物，會干擾內(nèi)分泌系統(tǒng)的功能以及激素的合成、釋放和代謝。EDCs應用于工業(yè)、農(nóng)業(yè)和日常生活中。然而，這些化學品的不當處置導致了多種 EDC（例如，表面活性劑烷基酚、增塑劑鄰苯二甲酸酯、阻燃多溴聯(lián)苯、殺蟲劑和合成樹脂材料雙酚等）的持續(xù)釋放。與其他 EDC 相比，這些污染物在水生環(huán)境（例如，地表水、地下水和廢水）中的普遍性和高含量的出現(xiàn)令人擔憂，并且可能造成環(huán)境影響，進而轉(zhuǎn)化為對水生動物的不利影響，海洋生物、水生生態(tài)系統(tǒng)和人類健康。
研究對象：常見環(huán)境內(nèi)分泌干擾物對斑馬魚行為的影響
該研究系統(tǒng)綜述了EDCs對斑馬魚行為的影響及其機制。在現(xiàn)有文獻基礎(chǔ)上，總結(jié)了典型EDCs（包括壬基酚、鄰苯二甲酸鹽、阻燃劑、有機磷殺蟲劑、有機氯蟲劑和雙酚等）在水環(huán)境中的檢出水平及其對不同發(fā)育階段斑馬魚行為的影響，包括運動活動、社交行為、記憶和焦慮相關(guān)行為以及求愛行為。列舉了斑馬魚暴露于EDCs的行為終點，從乙酰膽堿酯酶、多巴胺和氧化應激三個方面提出了EDCs對斑馬魚行為調(diào)控的潛在分子機制，確定了EDCs對斑馬魚的神經(jīng)毒性作用，概述了斑馬魚行為檢測在神經(jīng)科學研究中應用（圖1），分析了EDCs復合污染對斑馬魚的潛在風險。最后，提出了EDCs對斑馬魚行為影響研究的不足和今后的工作建議。
來源：Effects of common environmental endocrine-disrupting chemicals on zebrafish behavior
研究對象：雙酚A干擾斑馬魚內(nèi)耳發(fā)育的非雌激素作用機制
雙酚A (Bisphenol A, BPA)是雙酚類化合物家族中重要成員，被廣泛用于生產(chǎn)塑料和環(huán)氧樹脂消費品，包括水瓶、餐具和食品容器。自1936年首次在大鼠上觀察到BPA的類雌激素作用以來，BPA的類雌激素效應已經(jīng)在人類及多種動物模型中得到證實，是最具代表性的雌激素內(nèi)分泌干擾物。近年來，越來越多的研究人員利用斑馬魚模型開展魚類生殖生理、內(nèi)分泌學研究，包括環(huán)境內(nèi)分泌干擾物的作用及其機理，尤其是將基因編輯技術(shù)用于環(huán)境科學研究。
研究人員以斑馬魚雌激素核受體（esr1, esr2a, esr2b）和膜受體（gper1）敲除系為研究模型，提供了全面的遺傳和分子證據(jù)，證明BPA誘導的斑馬魚耳石發(fā)育異常不是通過干擾雌激素信號，而是通過非雌激素受體信號通路激活MEK/ERK-EZH2-H3K27me3信號通路，從而抑制otop1和stm的基因表達（圖5）。該研究還表明，斑馬魚作為最常用的生物模型之一，是研究環(huán)境污染物及其分子作用機制的良好體內(nèi)模型。
來源：Genetic and Epigenetic Evidence for Nonestrogenic Disruption of Otolith Development by Bisphenol A in Zebrafish
研究對象：胚胎期雙酚A暴露對斑馬魚眼結(jié)構(gòu)及視覺功能影響的研究
內(nèi)分泌干擾物的研究目前已成為國際研究新的熱點，探究胚胎期雙酚A(BPA)暴露對斑馬魚眼結(jié)構(gòu)及視覺功能的影響，為環(huán)境污染物暴露致子代視覺損害提供理論依據(jù)。
通過構(gòu)建胚胎期BPA暴露斑馬魚模型，體視顯微鏡觀察并測量幼魚的眼面積、眼長、體長；HE染色檢測幼魚視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)變化；;斑馬魚行為學檢測系統(tǒng)評估幼魚視覺行為。
結(jié)果:(1)50μmol·L-1BPA暴露后幼魚眼面積、眼身長比顯著減小；(2)BPA暴露后幼魚視網(wǎng)膜細胞排列擁擠，分層紊亂，感光細胞層細胞排列不齊；(3)受精后24h(24 hpf)BPA暴露組的斑馬魚胚胎擺尾活動減少；96、120hpf幼魚動眼頻率和幅度降低；120、144hpf幼魚自主運動能力顯著下降，游泳距離顯著縮短。該研究表明，胚胎期BPA暴露可造成斑馬魚眼結(jié)構(gòu)的改變和異常的視覺行為，說明環(huán)境污染物會影響子代視覺的發(fā)育，提示兒童眼保健應從孕期保健開始。
來源：胚胎期雙酚A暴露對斑馬魚眼結(jié)構(gòu)及視覺功能影響的研究
斑馬魚在抗生素上的應用
研究對象：抗生素在斑馬魚模型中的代際傳播機制
盡管已知各種抗生素對水生生物具有直接毒性，但代際傳播對生殖的潛在慢性影響仍然難以捉摸。在這里，我們將斑馬魚暴露于15種常用抗生素的混合物中，其濃度與環(huán)境相關(guān)（1和100μgL–1） 采用交叉配接設(shè)計。在卵巢中檢測到抗生素的大量積累（高達 904.58 ng g–1）和睪丸（高達1704.49 ng g–1） 的 F0 魚。抗生素從 F0 代到下一代（F1 后代）的傳播得到證實，傳播率 （k我），范圍從 0.11 到 2.32。
與父系轉(zhuǎn)移相比，母體抗生素轉(zhuǎn)移明顯更高，因為與睪丸富集相比，通過卵巢富集和產(chǎn)卵傳遞的作用更大。在雌性和雄性父母接觸后發(fā)現(xiàn)的F1卵子的生殖和發(fā)育指標也有類似的損害。與F1相比，幾乎所有抗生素都在F2卵子中被消除。然而，在F2魚中仍然觀察到生殖和發(fā)育毒性反應，這表明抗生素濃度水平不是評估每一代毒性作用的唯一標準。這些發(fā)現(xiàn)揭示了抗生素在魚類模型中的代際傳播機制，并強調(diào)了它們在水生環(huán)境中的潛在和持久影響。
來源：Unraveling the Marine Microplastic Cycle: The First Simultaneous Data Set for Air, Sea Surface Microlayer, and Underlying Water
斑馬魚在微塑料上的應用
研究對象：微納米塑料對魚類生殖和跨代效應的影響
持續(xù)增長的微納米塑料（MNPs）環(huán)境污染引起人們的廣泛關(guān)注。研究結(jié)果表明，MNPs具有穿越魚類體內(nèi)各種生物屏障并在其中蓄積的能力。鑒于魚類作為人類膳食的重要來源，以及魚類在生態(tài)系統(tǒng)中的關(guān)鍵作用，深入了解MNPs對其生殖和后代的多方面影響顯得至關(guān)重要。
該研究以水生環(huán)境中大量微納米塑料（MNPs）污染為背景，系統(tǒng)總結(jié)了不同種類的魚在MNPs在單獨暴露及與其他環(huán)境污染物共同暴露情況下，其生殖毒性和傳代效應所受到的影響。并基于中樞神經(jīng)系統(tǒng)與生殖健康密切相關(guān)的概念，提出利用神經(jīng)行為學來快速評價生殖毒性，為評估水生環(huán)境中生殖毒性的方法提供了新的視角。
研究中，論述了MNPs對斑馬魚生殖毒性的評估指標，包括性腺生長指數(shù)、繁殖能力（如產(chǎn)卵量和配子質(zhì)量）、性腺組織學、性激素表達測定、下丘腦-垂體-性腺軸基因表達分析。此外，還探討了可能導致傳代效應的途徑，包括MNPs在配子中的積累、對配子質(zhì)量的影響以及通過影響下丘腦-垂體-腎上腺軸、生長激素/胰島素樣生長因子激素水平對子代造成影響。最后，提出了結(jié)合計算機分子對接技術(shù)，在慢性、低水平、長期暴露下進一步闡明生殖傳代效應分子機制的研究方向，并提出利用神經(jīng)行為學來快速評價生殖毒性，為環(huán)境保護和生態(tài)健康提供更為深刻的見解。
來源：The invisible Threat: Assessing the reproductive and transgenerational impacts of micro- and nanoplastics on fish
近年來，斑馬魚技術(shù)在新污染物評價、毒理學研究等方面正日益發(fā)揮著越來越重要的作用。環(huán)特生物依托于斑馬魚+哺乳動物+類器官+基因編輯4大技術(shù)平臺，基于過去10余年持續(xù)的創(chuàng)新實踐，以專業(yè)、前沿的技術(shù)服務(wù)解決方案，助力新污染物毒性評價與毒理學研究，開創(chuàng)斑馬魚技術(shù)應用新時代！
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