題目：Widespread and functional RNA circularization in localized prostate cancer
期刊：Cell
影響因子：31.2
主要技術：circRNA-Seq / circRNA pull-down
研究背景
前列腺癌是全世界男性最常見的惡性腫瘤之一，一旦腫瘤遷移到腺體外就不可避免地會出現無法治愈的轉移性疾病。因此，在臨床上研究局部可治愈的前列腺腫瘤的生物學特性是非常有必要的。
circRNA是一個穩定的共價閉合環，可躲避poly-A的捕獲，具有創造生物標志物的潛力。雖然已經有研究者挖掘癌癥基因組圖譜網絡和評估組學信息，但是前列腺癌轉錄組的完全多樣性及其意義仍然是未知的。
本文作者選取了臨床144例局限性前列腺腫瘤樣本進行超深度RNA測序，共識別了1233個獨特的融合基因和76311個不同的circRNAs，并確定了171個對前列腺癌細胞增殖至關重要的circRNAs。由此可見，本次轉錄組數據中包含許多傳統分子策略無法觀察到的功能實體，為將來RNA轉錄組研究提供了豐富的資源。
研究內容及結果
1. 局限性前列腺癌的轉錄組分析
本文對144例前列腺腫瘤樣本進行轉錄組分析，發現在所有腫瘤中有18340個轉錄本（圖1A-1B，其中包含15112個蛋白質編碼亞型）。結合癌癥基因組圖譜網絡，按四分位間距排列前25% RNA并進行聚類分析，發現4585個轉錄本中包含3905個編碼RNA和680個非編碼RNA（圖1C），并描述了5個患者亞型（P1-P5）和5個RNA亞型（R1-R5）。
為確定候選腫瘤特異性亞型，從而評估融合基因的結構以及與侵襲性局部疾病的關系，發現有21例復發率超出預期的復發性融合（圖1D），并在超過10% SU2C轉移轉錄本中發現復發融合（圖1E，有17個高豐度的融合物，有12個在轉移病灶中復發）。結果揭示融合基因的轉變可能預示著對治療效果、轉移部位和疾病進展的選擇性適應。
圖1 局限性前列腺癌的轉錄組學特征
2. 局限性前列腺癌的circRNA表達譜
作者針對前列腺癌患者的腫瘤和細胞系展開序列分析和聯合治療，確定了34286個circRNAs，其中有33806個在RNase R處理后至少增加了1.5倍（圖2A）。將重疊區域中高信度的25036個circRNAs與circBase注釋進行比較，發現11例細胞或組織源中僅有1例檢測到67%的circRNAs（圖2B-2C）。
在基因水平上檢測每個樣本的親本線性、全線性和環狀的分子分數，其親本線性形式的高值表明了幾乎所有腫瘤的基因都有產生circRNA的傾向（圖2D）。采用STAR方法評估每個基因的八個特征并量化其環化的能力，結合ROC曲線來預測RNA環化事件并分析與豐度的相關性，結果表明circRNA環化產生所需的一些信息被嵌入到基因組中。高豐度circRNA往往具有高豐度線性親本RNA對應物（圖2E-2F），統計發現有127個circRNA的豐度顯著地高于線性對應結構（圖2H）。
圖2 前列腺癌中circRNAs的鑒定與表征
3. circRNA豐度定義臨床上不同的腫瘤亞型
將144例腫瘤患者樣本分成四組份，采用circRNA-Z評分來量化特定的腫瘤亞型（圖3A）。通過比較CPC-GENE和NGS-ProToCol隊列發現，在預后水平上極端（Q1/Q4）患者組的circRNA分布情況明顯弱于穩定（Q2/Q3）患者組（圖3B- 3C），且伴隨著較高的轉移發生率（圖3D）。通過比對CPC基因數據集中轉錄豐度與BCR注釋關系（圖3E），發現總circRNA和特異circRNA豐度均與臨床結果相關，重點提示了circRNA并非是轉錄噪音而是可能具有特定的致癌功能。
圖3 circRNA失調與前列腺癌進展有關
4. 功能篩選識別關鍵的circRNA
如圖4A中shRNA定位策略示意圖所示，通過后剪切位點設計shRNAs來篩查circRNA的特異性功能，由此針對1507個circRNA和1075個線性轉錄物均至少配有2個shRNAs（圖4B）。采用MaGeCK來鑒定耗盡的線性轉錄物和提高篩選有效性，發現在V16A細胞系中陽性對照組明顯高于陰性對照組，歸一化后shRNA豐度變化與時間點呈現高度相關（圖4C-4D）。由此逐步確定，在一個細胞系中總共至少有171個關鍵的circRNAs，其中91.8% circRNAs是必需的而其線性對應物是非必需的（圖4E-4F）。同時在四個細胞系中對10個關鍵的circRNAs進行敲除（KD）和過表達（OE）后測定細胞增殖情況，并結合LNCaP CRISPR數據庫篩查（圖4G-4H），發現circRNA驅動細胞增殖的過程獨立于其線性對應物。
圖4 shRNA篩選和關鍵circRNAs的驗證
5. 關鍵circRNAs的功能表征
在10個關鍵的circRNAs中，circCSNK1G3總長度為536 bp且包含了三個外顯子，在CPC基因隊列中發現其與線性對應物的豐度相似（環狀：線性 = 0.79，圖5A和5B）。通過對circCSNK1G3-OE/-KD處理的PC-3細胞進行RNA序列分析，發現許多基因在OE樣本和KD樣本呈現反向變化趨勢，并統計出279個激活基因和196個抑制基因（圖5C），同時觀察到在circCSNK1G3- KD樣本中有環狀和線性亞型共享的6個靶基因（圖5D）。在測序報告注釋后發現circCSNK1G3激活基因與細胞周期相關且促進細胞增殖，而CSNK1G3激活的關鍵是對酸性化學物質的反應（圖5E-5F），這些數據均表明circCSNK1G3可促進前列腺癌細胞的增殖但不依賴于其線性轉錄本。
圖5 circCSNK1G3的基礎功能表征
6. circCSNK1G3與miR-181b/d互作促進前列腺癌細胞增殖
結合銀酸交聯和免疫沉淀測序（AGO-CLIP-Seq）數據進行分析預測，作者篩選出與circCSNK1G3互作的10個候選miRNAs。通過對CPC基因隊列亞群（n=119）中miRNA數據集分析，發現有5個miRNA（miR-181a/b/c/d 和 miR-196b）與circCSNK1G3表達顯著相關（圖6A），并預測出高度飽和的AGO結合位點在外顯子2區域（圖6B）。接著通過生物素標記circCSNK1G3進行RNA pull-down實驗，觀察到只有miR-181b/d顯著地富集（圖6C），且miR-181b/d反向驗證實驗也證實了這一點（圖6D）。在miR-181b/d-OE的PC-3細胞中發現細胞增殖和CBX7豐度顯著地下調，在circCSNK1G3-KD驗證實驗中發現mir-181b/d顯著地下調和cbx7顯著地上調，推測出CBX7作為前列腺癌中miR-181b特征靶點和腫瘤抑制因子（圖6E-6F）。與此同時，發現細胞周期基因（如CDK1和CDC25A）在miR-181b/d-OE細胞中上調且在circCSNK1G3-KD細胞中下調。綜上所述，circCSNK1G3至少部分地參與miR-181b/d相互作用來促進前列腺癌細胞增殖。
圖6 miR-181b/d部分挽救了circCSNK1G3的丟失
文章小結
本文旨在探討深層RNA序列中原發腫瘤的價值，并首次報道了具有功能注釋的circRNAs，揭示了一種與侵襲性導管內癌組織學相關的線性轉錄亞型和一種區分局限性轉移性疾病的融合特征，并為后期RNA轉錄組研究提供豐富的資源。
與此同時，反式剪切事件表明了廣泛的RNA發生環化，在腫瘤細胞中平均有7232個circRNA表達，結合多個患者樣本數據分析得到circRNA產生的程度與疾病進展相關。功能缺失篩查發現11.3% 的高豐度circRNA對細胞增殖至關重要，其中90%與線性轉錄本并不相關。不同circRNA具有不同的特異性功能，例如circCSNK1G3通過與miR-181相互作用促進腫瘤細胞增殖。綜上所述，相對于線性轉錄本而言，circRNA顯示出獨特的本質信息，對后期臨床研究具有重要的作用。
解析文獻
Chen S, Huang V, Xu X, et al. Widespread and functional RNA circularization in localized prostate cancer. Cell. 2019 Feb 7; 176(4): 831-843.