編者按
由于廣泛的組織損傷和修復不足，人類脊髓損傷（SCI）可導致感覺和運動功能永久性喪失。然而，面對機體免疫系統過度反應所引起的炎癥，患者的治療或許會表現為效率低下，而免疫系統通常能保護機體抵御感染；通過抑制整個機體免疫反應來減少炎癥的藥物或許也能抑制促進機體修復的免疫細胞。
今天我們來分享一篇2023年由愛丁堡大學科學家們發表在國際雜志Theranostics上，題為“Drug screening in zebrafish larvae reveals inflammation-related modulatorsof secondary damage after spinal cord injury in mice”的研究文章中，這項研究測試了1000多種能改善脊髓損傷恢復的潛在藥物，并發現了一種非常有希望的新型療法途徑。
文章題目
Drug screening in zebrafish larvae reveals inflammation-related modulatorsof secondary damage after spinal cord injury in mice
雜志：《Theranostics》
影響因子：IF=12.400
發表時間：2023年第13卷第8期
翻譯：黃燕峰
作者：Catherina G. Becker等
單位：愛丁堡大學
01、研究背景
由于廣泛的組織損傷和修復不足，人類脊髓損傷（SCI）可導致感覺和運動功能永久性喪失。原發性組織損傷是由撞擊直接造成的，而繼發性損傷則是由于血脊髓屏障的破壞而導致更廣泛區域發生的繼發性損傷。這通常伴有慢性炎癥。
雖然免疫反應可以對組織修復產生有益的影響，但它也可以加劇組織損傷，具體取決于免疫細胞的表型或激活狀態。脊髓損傷后，免疫細胞在很大程度上表現出促炎狀態，包括釋放 IL-1β，這會對哺乳動物和斑馬魚脊髓損傷后的恢復產生負面影響。這種主要由巨噬細胞和小膠質細胞組成的極化通常被稱為 M1（促炎癥）或 M2（促再生），在體內觀察到許多混合激活狀態。
研究者使用il-1β熒光斑馬魚系來篩選一組潛在有益的脊髓損傷免疫調節劑藥物。研究發現組胺受體2b拮抗劑西米替丁抑制il-1β在斑馬魚幼魚中的表達，并部分恢復irf8斑馬魚慢性炎癥突變模型中受損的再生。重要的是，在中度脊髓挫傷小鼠模型中，該藥物調節了免疫反應，導致顯著的組織保留和改善功能恢復。這項研究強調了斑馬魚脊髓損傷模型在快速篩選藥物庫以尋找治療目前沒有有效治療方法的哺乳動物脊髓損傷的潛在療法的有用性。
02、主要研究結果
1、斑馬魚幼蟲脊髓損傷的篩查，揭示了西米替丁作為病變引起的炎癥的調節劑
研究者利用il-1β表達熒光斑馬魚在不同化合物中預孵育4h，然后用相同的化合物對脊髓進行人工損傷和損傷后處理。
通過篩選，最終三種化合物被發現可以將內源性il-1β mRNA的表達降低至少40%。按照療效排序，這些藥物分別是硼替佐米、西米替丁和檸檬酸西地那非。對前三種化合物的獨立重新測試證實了硼替佐米和西米替丁對il-1β mRNA水平的具有影響，但西地那非對il-1β mRNA水平沒有影響(圖S1A-C)。通過篩選研究者發現濃度在 10 至 50 µM 之間的西米替丁對于減少 mRNA 也同樣有效（圖1D） 或il-1β報告基因表達情況。
2、西米替丁降低中性粒細胞對損傷的反應
研究者使用免疫組織化學方法分析了Mpx在il-1β:GFP細胞系(標記表達il-1β的中性粒細胞)中的中性粒細胞反應。研究者通過統計中性粒細胞數量以及巨噬細胞數量，進一步加強了西米替丁具有抗炎作用的觀點。
3、西米替丁改善再生缺陷突變斑馬魚長時間炎癥的恢復
研究者認為西米替丁應該能夠改善斑馬魚長期炎癥模型的再生結果。為了評估損傷后的解剖恢復情況，研究者將所有神經元組織標記到irf8突變系中。
研究者重現了先前報道的與野生型幼蟲相比，irf8突變體的解剖恢復減少。用西米替丁孵育可顯著增加損傷部位橋接的irf8突變體的比例，但對野生型動物無顯著影響。通過測量軸突橋的厚度，證實了西米替丁對irf8突變體幼蟲軸突再生的部分恢復作用。這表明西米替丁可以改善長時間炎癥突變體的軸突再生，并且對野生型動物的再生沒有影響。
4、西米替丁通過hrh2b起作用
為了確定本研究觀察到的西米替丁的作用機制是否通過靶向調節HRH2受體信號介導。研究者首先分析了il-1β熒光魚中，西米替丁與GFP熒光之間的劑量效應關系，以及特異性HRH2激動劑與GFP熒光之間的劑量效應關系。正如預期的那樣，西米替丁治療導致熒光呈劑量依賴性降低，而倍唑則導致GFP熒光呈劑量依賴性增加。這表明Hrh2受體對脊髓損傷后il-1β表達水平有積極作用。
為了確定這些基因（hrh2a和hrh2b）中哪一個對西米替丁對il-1β表達水平的作用起作用。研究者測試了西米替丁對脊髓損傷后hrh2a和hrh2b體細胞突變體的作用，這些突變體是在il-1β:GFP報告系的背景下基因編輯的。hrh2b的體細胞突變不影響幼蟲的整體發育或軸突橋接恢復，游泳行為也顯示未受損的恢復。hrh2a和hrh2b的雙突變對游泳的恢復也沒有影響，說明hrh2a不能彌補hrh2b的缺失。同樣，用西米替丁阻斷Hrh2受體也不會損害游泳功能的恢復。在以hrh2a為靶點的動物中，西米替丁在il-1β:GFP報告魚損傷后仍然能夠降低GFP熒光。
研究者通過qRT-PCR評估了西米替丁對脊髓損傷部位hrh2a mRNA和hrh2b mRNA的表達水平。研究者可以檢測到這兩種受體在對照組和病變動物。西米替丁治療后，hrh2b mRNA的相對表達水平在受損動物中升高，而hrh2a mRNA的相對表達水平沒有升高，而在未受損動物中沒有升高?？傊?，這些實驗支持西米替丁對il-1β表達的作用依賴于hrh2b受體的存在。
5、脊髓損傷增加小鼠脊髓損傷后HDC和H2受體染色的表達
通過免疫熒光染色確定，研究者在未損傷小鼠脊髓背角檢測到極弱的組胺脫羧酶(HDC)標記。脊髓損傷后48小時，背角神經元的HDC標記明顯增加，西米替丁治療后這種增加明顯減少。脊髓損傷48小時后，脊髓背角淺層和脊髓腹外側區血管中HRH2染色顯著增加。經西米替丁處理后，HRH2染色升高的程度降至對照水平。
6、西米替丁促進小鼠脊髓損傷后運動恢復和減輕小鼠脊髓損傷后的繼發性損傷
考慮到斑馬魚irf8突變體的恢復改善，研究者評估藥物對脊髓損傷小鼠模型恢復的影響。研究者對成年雌性進行深度麻醉和中度挫傷，然后評估運動恢復。西米替丁治療小鼠損傷后21天開始運動恢復有顯著改善。分析顯示，西米替丁治療增加了推進時間，減小了步距角。
研究者評估了西米替丁對各種組織學指標的影響。通過對28天評估損傷大小、髓磷脂損失、神經元損失和血清素能神經支配密度評估，所有的組織學參數都顯示西甲替丁治療的脊柱組織有顯著的改善。
7、西米替丁促進小鼠脊髓損傷后運動恢復和減輕小鼠脊髓損傷后的繼發性損傷
研究者通過qRT-PCR評估IL-1β mRNA水平。西米替丁治療顯著降低了斑馬魚中il-1β的表達。研究者還通過免疫熒光染色在蛋白水平上評估IL-1β表達的變化。在未損傷的脊髓中幾乎檢測不到IL-1β的免疫標記，但在脊髓損傷后48小時顯著增加。
接下來，評估了脊髓損傷后更長時間的西米替丁治療10天是否會更廣泛地調節小鼠損傷后的免疫反應?？偟膩碚f，結果表明西米替丁改變脊髓損傷后的炎癥反應，使其更有利于再生。隨后，評估了西米替丁治療是否會影響炎癥細胞的浸潤和活化。
研究者發現，在脊髓損傷后4周，西米替丁治療減少了病變部位CD11b+巨噬細胞/小膠質細胞的數量和CD11b染色的程度。與對照組相比，西米替丁治療減少了損傷中心的脂質過氧化這些結果進一步證明西米替丁可以減輕小鼠脊髓損傷后的炎癥和脂質過氧化。
03、編者點評
綜上，本研究表明通過斑馬魚幼體的藥物篩選試驗，組胺 H2 受體拮抗劑西米替丁可作為脊髓損傷后的免疫調節劑。西咪替丁可調節斑馬魚和小鼠的免疫反應，并促進斑馬魚模型和脊髓損傷后成年小鼠的恢復。小鼠功能恢復的增加伴隨著更廣泛的神經組織的保存。
作為健康美麗產業CRO服務開拓者與引領者、斑馬魚生物技術的全球領導者，環特生物搭建了“斑馬魚、類器官、哺乳動物、人體”四位一體的綜合技術服務體系，開展健康美麗CRO服務、科研服務、智慧實驗室搭建三大業務。目前，環特已建立200多種斑馬魚模型及多種類器官培養平臺，歡迎有需要的讀者垂詢！
參考文獻
[1]Dumont RJ, Okonkwo DO, Verma S, Hurlbert RJ, Boulos PT, Ellegala DB. et al. Acute spinal cord injury, part I: pathophysiologic mechanisms. Clin Neuropharmacol. 2001;24:254–64.
[2]McDonald JW, Sadowsky C. Spinal-cord injury. Lancet. 2002;359:417–25.
[3]Sekhon LH, Fehlings MG. Epidemiology, demographics, and pathophysiology of acute spinal cord injury. Spine (Phila Pa 1976) 2001;26:S2–12. [PubMed] [Google Scholar
[4]Greenhalgh AD, David S, Bennett FC. Immune cell regulation of glia during CNS injury and disease. Nat Rev Neurosci. 2020;21:139–52. [PubMed] [Google Scholar]
[5]Chio JCT, Xu KJ, Popovich P, David S, Fehlings MG. Neuroimmunological therapies for treating spinal cord injury: Evidence and future perspectives. Exp Neurol. 2021;341:113704.
[6]Boato F, Rosenberger K, Nelissen S, Geboes L, Peters EM, Nitsch R. et al. Absence of IL-1beta positively affects neurological outcome, lesion development and axonal plasticity after spinal cord injury. J Neuroinflammation. 2013;10:6.
[7]Kroner A, Greenhalgh AD, Zarruk JG, Passos Dos Santos R, Gaestel M, David S. TNF and increased intracellular iron alter macrophage polarization to a detrimental M1 phenotype in the injured spinal cord. Neuron. 2014;83:1098–116.
[8]Tsarouchas TM, Wehner D, Cavone L, Munir T, Keatinge M, Lambertus M. et al. Dynamic control of proinflammatory cytokines Il-1β and Tnf-α by macrophages in zebrafish spinal cord regeneration. Nat Commun. 2018;9:4670.
[9]Paolicelli RC, Sierra A, Stevens B, Tremblay ME, Aguzzi A, Ajami B. et al. Microglia states and nomenclature: A field at its crossroads. Neuron. 2022;110:3458–83.