腫瘤分子分型：通過NGS、蛋白質組等組學技術，對腫瘤進行分子譜的系統描繪，并根據分子特征譜，進行腫瘤的精準分類及精準診療研究。分子分型已成為國家精準醫療戰略的重點研究投入方向；也備受CNS頂刊雜志青睞。為了幫助廣大臨床研究者了解腫瘤分子分型及診療研究的重大前沿進展，我們收集整理了近幾年來發表于Cell、Nature、Cancer Cell等頂刊上的，基于蛋白質組及蛋白基因組的腫瘤分子分型相關研究論文。【腫瘤分子分型專輯】每周1篇，為大家精細解讀重磅研究與進展。
【文章題目】：Integrated Omics of Metastatic Colorectal Cancer
【癌種】：腸癌
【細分癌種】：早期非轉移性&轉移性結直腸癌（CRC）
【地域】：中國大陸
【通訊單位】：中科院上海生化細胞所
【發表時間】：2020年
【涉及組學】：全外顯子測序、DNA甲基化芯片、DIA蛋白組學、DIA磷酸化蛋白組學
【文獻出處】：
DOI: https://doi.org/10.1016/j.ccell.2020.08.002
1.針對中國患者轉移性結直腸癌的大規模蛋白基因組學研究，繪制首個中國人結直腸癌多組學整合分子特征譜
2.蛋白質組學與磷酸化蛋白組學圖譜可成功識別腫瘤轉移并預測藥物反應
3.建立了完整的從多組學數據集生成到in vivo藥物敏感測試模型的分析流程
4.改進對無可用藥物突變型患者的治療策略的選擇
【流行病學】：
結直腸癌(CRC)是全球第四大致命性癌癥，每年有近90萬人死亡。年齡、不良的飲食和生活方式都會增加結直腸癌的風險。盡管治療手段不斷進步，但CRC，特別是轉移性CRC的死亡率在癌癥相關死亡中仍然很高。CRC表現出高度的異質性。
多組學特征預期有助于改善治療，從而導致精確和個性化的護理。已有的多組學研究更多地關注非亞洲人口中的非轉移性CRC，對于中國的患者的治療并不完全適用。
【主要驅動基因】：APC, TP53，KRAS
【主要樣本】：早期-非轉移性CCRC、轉移性CCRC患者，經手術切除的組織（原發癌組織（T），近端癌旁組織（P），遠端正常組織（N））；及轉移性CCRC的遠端肝轉移腫瘤組織（LM）
【樣本狀態】：新鮮冰凍
【樣本數量】：76對早期-非轉移CCRC、70對轉移性CCRC、43例遠端肝轉移灶
【主要研究路線與內容】：
1. 單組學分析：組別：原發灶癌組織（T） VS 遠端正常組織（N）；
轉移灶癌組織（LM） VS 遠端正常組織（N）等WES：基因拷貝數、基因突變；與TCGA隊列比較
DIA蛋白組 & MRM靶向蛋白組：蛋白鑒定與定量數量
DIA磷酸化蛋白組：修飾蛋白、修飾肽段鑒定與定量數量
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二、原發灶-中國人群結直腸癌（CCRC）基因組情況
1. 對146例患者組織樣本進行基因組學檢測，最常見的突變基因為APC(65%)，TP53(64%)以及KRAS(32%)。
2. 中國人群特征：我國隊列CCRC數據，與TCGA以及MSK數據比較
（1）病理差異：三個隊列臨床病理特征存在明顯差異，且CCRC中直腸癌發病率更高，轉移性CRC（mCRC）的比例更高。
（2）基因突變差異：中國人群的CCRC特有突變特征，包括APC和TP53突變頻率略低，而PRRC2A、PPFIA4、CPD和NURP1L等突變頻率更高。3.轉移性CRC特征：對中國人群中轉移性與非轉移性人群（mCCRC與non-mCCRC）進行了基因突變特征的對比：①mCCRC整體突變負擔更低；②SMAD4和XIRP2基因突變頻率升高；③多克隆結構增多。鑒定了中國人群CCRC的主要基因突變；同時對比了mCCRC與non-mCCRC的基因突變特征，建立了完整的中國人群CCRC基因變異景觀。1.蛋白質組分型：作者對146名CCRC患者原發腫瘤和遠端正常組織進行DIA蛋白組學分析，通過共識聚類將其分成三個亞型（CC）：CCI型集中在RNA加工和DNA錯配修復（MMR）；CC2型集中在細胞外基質-受體整合、粘著斑和免疫相關途徑；CC3型集中在DNA復制和代謝途徑激活。2.亞型的臨床預后特征：三種亞型具有不同的無復發生存率，亞型是獨立預后因素。此外，對于轉移性患者，CC3型也較CC1/2型預后差。3.亞型的分子表達特征：（1）CC3型：三個亞型之間的差異突變基因、SCNA以及差異蛋白有一定重疊，更多的突變顯著富集于CC3型；其中大多數SCNA在CC3亞型中出現更多的拷貝數刪除，并在蛋白水平上出現更高的表達。（2）CC2型：DNA錯配修復（MMR）通路相關蛋白在CC2型中顯著下調。DNA甲基化分析發現其基因甲基化水平明顯與蛋白表達水平負相關。說明CC2型具有獨特的表觀遺傳特征。
4.與其他已報道分型的比較：將該蛋白質組分型與CPTAC蛋白質組數據集以及CMS分類進行比對，發現分型結果總體上保持一致：CC1型與CPTAC亞型A和E相匹配，分別包含CMS1和CMS3，并且預后相對較好；CC2型，與C和CMS4亞型相似，預后比CC1型差；CC3型蛋白質組對應于CPTAC B型，以及多種類型的CMSs，體現了該亞型的復雜性。
利用蛋白質組學數據建立了CRCC三種分型，三種亞型具有不同的分子和預后特征，且與已有數據集的分型具有一致性。
四、原發灶—磷酸化蛋白質組的CCRC分子分型：磷酸化蛋白組學可以區分mCCRC與non-mCCRC
1. 磷酸化蛋白組的分型：研究者對CCRC患者的原發腫瘤和遠端正常組織進行DIA磷酸化蛋白質組學分析，從中發現了1487個差異磷酸化位點。進一步通過共識聚類，將其分為六個亞型。有趣的是，磷酸化蛋白組學數據可將non-mCCRC與mCCRC進行分離（SC1、3、5型富含mCCRC患者；而SC2、4、6型富含non-mCRC患者），但基于蛋白組學的三種亞型中mCRC與non-mCRC沒有顯示出明顯的區分。2.磷酸化蛋白亞型的分子功能特征：對差異磷酸化的蛋白質進行了功能富集分析，發現在SC1，SC3和SC5中高表達的磷酸化蛋白在粘著斑和粘附連接途徑中富集；在SC2，SC4和SC6中上調的磷酸位點則在ERBB2信號轉導、子宮內膜癌、抗原加工和呈遞及FcγR介導的吞噬途徑中富集，這些上調的磷酸化蛋白在亞型間的特性不強。3.磷酸化蛋白亞型的激酶-底物關聯特征：激酶底物關聯分析發現，SC1，SC3和SC5中的激酶與磷酸酶之間大多呈負相關，而SC2和SC4中的正相關則呈正相關。比較特殊的是SC6，其特征為激酶與底物之間呈負調控，這表明CC3中的non-mCRC更像是mCRC，且具有較差的預后。磷酸化蛋白組學可以更細分mCRC與non-mCRC，對蛋白質組學分析做有效補充。此外，不同的亞型具有不同的磷酸化-底物關聯特征，并且可能與預后有關。
基因組水平：原發灶和轉移灶在基因水平上整體具有高度一致性，包括驅動基因突變及SCNA。與原發灶相比，轉移灶的單克隆比例更高。這些結果表明轉移灶源自原發灶或相同的祖先克隆。
2.蛋白組水平：轉移灶的蛋白質組學分析顯示與原發灶明顯不同。與原發灶相比，轉移灶比正常組織表現出更多的蛋白表達上調，這些差異表達的蛋白質清楚地將轉移組織與原發組織區分開：1）轉移灶中上調蛋白主要集中在ECM-受體互作、藥物代謝、細胞粘附和緊密連接相關；2）轉移灶中下調蛋白集中在代謝途徑、脂肪酸降解、TCA循環和氧化磷酸化中。轉移灶與原發灶的蛋白基因組學對比，顯示二者基因組學上的同源性與蛋白組水平上的異質性；相比于基因足，蛋白質表達差異可以有效地對轉移灶與原發灶進行區分。六、轉移性CCRC的磷酸修飾位點與蛋白的表達協變特征1. 磷酸化位點與蛋白的表達相關性：研究者分析了42例mCRC患者（10例CC1型，21例CC2型，11例CC3型）的所有四種組織類型（N，P，T和LM）。研究者針對每一例mCRC，計算了所有4個組織中每兩個匹配的磷酸化位點豐度和蛋白質豐度之間的相關系數。為進一步尋找三種CC亞型的磷酸化位點-蛋白共調控關系，研究者利用ANOVA鑒定出了在三種亞型中存在顯著差異的954種磷酸化-蛋白關系對（CC2表現出明顯的負向調控、CC1和3表現出更多的正相關）。
2.磷酸化位點-蛋白對的分類及特征：（1）這954個磷酸化-蛋白關系對可將三個亞型進行有效區分，并且可被分為三個cluster：CC1neg、CC2neg和CC3neg。CC3neg富集于平滑肌收縮、傷口響應等功能；CC1neg于LIS1途徑、內吞作用、P75 NTR受體信號等；CC1neg顯著參與mRNA代謝過程、核糖核蛋白復合生物發生等。（2）利用激酶底物注釋，進一步發現CC3neg具有最多的激酶富集，且3種cluster無共有上游激酶。對應于10激酶的14個磷酸化位點存在顯著的共同調節。
（3）研究者利用MCODE復合/子網絡分析方法，發現了五個核心網絡，包含了112個節點和355個連接，并對CC1neg、CC2neg和CC3neg中的特異的核心網絡進行了展示。其中TP53和LKB1通路是CC1neg和CC3neg的top MCODE；而mRNA 剪切體復合物是CC2neg的top。磷酸化位點-蛋白的相關性分析顯示，即使是同一個病人，其不同的組織（N，P，T和LM）中存在的磷酸化-蛋白的關聯具有不同的特征，且與亞型相關。1. 亞型的激酶活性特征：作者對每種CC亞型的mCRC原發和轉移組織中差異豐富的磷酸化位點進行分析，并推斷出相應激酶的活性。作者發現不同的CC亞型富含不同激酶。且同一亞型的原發灶與轉移灶中，同一激酶也會表現出不同活性。例如CDK5僅在CC1型的原發灶表現出高活性；MAPK1在CC3型的原發灶和轉移灶均具有高活性，但在其他亞型中無此活性。
2.亞型的激酶-磷酸化底物表達與網絡特征：進一步同時考慮蛋白表達水平的變化。作者發現激酶及底物的表達在不同亞型中也同樣具有高度異質性。進一步基于蛋白-底物相關系數，構建不同亞型原發灶及轉移灶的共表達網絡。同樣的，蛋白-底物網絡也呈現出不同亞型及不同組織間的特異性差異；并且同一亞型的原發灶與轉移灶之間的差異，大于各亞型的原發灶之間的差異。
通過分析不同亞型中的激酶表達與活性，揭示了潛在的藥物治療靶點。但無論是激酶活性，還是激酶-底物表達網絡，均呈現出原發與轉移灶間的高度異質性，提示即使是同一病人，其不同組織對藥物的敏感性也可能會不同。1.三種激酶抑制劑的PDX模型治療響應測試：為進一步探索mCCRC患者藥物反應潛力，研究者對31種miniPDX模型中的三種激酶抑制劑（阿法替尼、吉非替尼和雷戈非尼）進行藥理測試，其中包括9對原發性轉移腫瘤和13種原發腫瘤。研究者通過腫瘤生長抑制來評估不同藥物效果，并進一步確定同一人的原發灶和轉移灶對同一藥物表現出不同的反應。此外，值得注意的是，CCRC-0323 組織具有regorafenib的高響應，與其具有RAF1基因突變一致；但雖然其同樣存在ERBB2基因突變，但卻對ERBB2抑制劑afatinib無響應。而CCRC-0397組織，沒有RAF1突變，卻對上述兩種抑制劑均有良好的響應。此結果表明，磷酸化蛋白組對藥物選擇的指示比基因突變信息更敏感。2.藥物治療響應預測模型：研究者建立了基于1696個邊緣強度特征的彈性回歸模型，用于預測藥物反應。該模型對上述抑制劑響應的預測結果，與實際結果具有高度一致性，證實激酶-磷酸底物網絡在預測mCCRC患者藥物敏感性方面具有強大潛力。此外，作者發現EFGR與PTPN1-Y8的正相關性，以及EFGR與IRS1-S3的負相關性，均對afatinib的響應有貢獻，說明藥物響應并不是單因素決定的，而需要多個分子信息協同指征。進一步證實了同一病人的不同組織對藥物的敏感性會有所不同?；诩っ?底物表達網絡，構建了能夠有效預測藥物治療響應的模型。同時，進一步強調了蛋白水平、磷酸化水平，以及多分子水平對藥物選擇的必要意義。
?該研究系統性分析了146例中國人群隊列的結直腸癌患者組織的基因組學、蛋白質組學和磷酸化蛋白質組學數據，包括其中的70例轉移性患者。蛋白質組學區分了三種CCRC亞型，各亞型具有不同的臨床預后和分子特征；磷酸化蛋白組學數據有助于進一步區分轉移和非轉移患者。原發灶與轉移灶表現出基因水平的高度相似性，但在蛋白組水平上存在顯著差異。該研究進一步構建了激酶-底物網絡模型進行藥物響應的預測，并進行了PDX模型的藥效學測試驗證。藥效測試結果進一步發現：即使同一患者，原發灶和轉移灶對同一藥物也表現在不同的藥物敏感性；激酶-底物對藥物敏感性的預測，比藥靶基因信息更加敏感和有效。綜上所述，該研究為中國人CRC研究提供了有價值的數據資源，有利于更好地理解轉移性CRC，并提供了臨床應用的潛力。
