T細胞急性淋巴細胞白血病 (T-ALL) 是一種侵襲性血液惡性腫瘤，其中約有75%的病例是由Notch1基因突變導致的，因此Notch1的抑制劑GSI常被用作該病的靶向用藥。然而，臨床上常出現原發性耐藥或復發性耐藥，這大大限制了GSI作為T-ALL靶向用藥的臨床效果。 2021年5月丹麥哥本哈根大學Jesper V. Olsen團隊在Nature Communications（IF:14.919）雜志上發表題為 《Proteomics of resistance to Notch1 inhibition in acute lymphoblastic leukemia reveals targetable kinase signatures》的研究成果，利用蛋白組和DIA磷酸化修飾蛋白組找到了不同耐藥細胞共同的特征和新的藥物靶點。 【研究材料】 1. 固有耐藥模型：對GSI藥物具有固有耐藥的3種細胞系JURKAT、MOLT-3、PEER，藥物敏感的3種細胞系DND-41、HBP-ALL、ALL-SIL； 2. 獲得性耐藥模型I：從藥物敏感細胞系DND-41中篩選獲得性耐藥細胞株（persister cells）； 3. 獲得性耐藥模型II：從兩例臨床患者中分離到藥物敏感癌細胞系，利用PDX（patient-derived xenografts）小鼠模型篩選獲得性耐藥細胞株。 【技術方法】 蛋白組、DIA磷酸化修飾蛋白組 ?? 步驟1：建立3種GSI耐藥模型，采用蛋白組和DIA磷酸化組分析分子水平變化； ?? 步驟2：分析GSI固有耐藥模型的分子變化特征； ?? 步驟3：分析GSI獲得性耐藥模型的分子變化特征； ?? 步驟4：尋找模型間的耐藥調控共性，激酶底物分析找到關鍵激酶PKC，驗證其調控機制； ?? 步驟5：以PKC為新靶點，探討與Notch1抑制劑聯合用藥的效果。 1. 建立GSI耐藥模型 為了探索T-ALL癌細胞對GSI產生固有耐藥（Intrinsic resistance）和獲得性耐藥（acquired resistance）是否有共同的分子基礎，研究者建立了三種GSI耐藥模型。固有耐藥模型比較了耐藥細胞系JURKAT、MOLT-3、PEER和藥敏細胞系DND-41、HBP-ALL、ALL-SIL。獲得性耐藥采用了兩種模型，第一種模型是利用敏感細胞系DND-41篩選獲得性耐藥細胞株（persister cells），第二種模型是從兩例臨床患者中分離到藥物敏感癌細胞系，利用PDX小鼠模型篩選獲得性耐藥細胞株。研究者利用蛋白組學和DIA磷酸化修飾蛋白組學分析了三種模型的分子應答異同。 圖1 GSI固有耐藥模型和獲得性耐藥模型的組學分析流程 2. GSI藥物固有耐藥模型中的分子調控特征 GSI藥物敏感細胞系和耐藥細胞系的蛋白表達模式存在顯著不同，共發現596個差異表達蛋白，其中323個蛋白在耐藥細胞系中表達豐度更高。結合轉錄調控數據庫ChEA發現，這些差異蛋白存在兩個調控簇，預測其主調控因子分別是Notch1和Tal1。 GO富集分析發現，差異蛋白功能主要集中在氨基酸代謝、脂肪酸降解、活性氧清除等過程。將差異蛋白在藥物響應數據庫CMap比對發現，細胞對GSI藥物敏感性應答與蛋白合成抑制劑伊米丁和mTOR抑制劑的表達特征相似性最高。與之相契合的是，在磷酸化修飾組中差異修飾的蛋白功能也顯著富集了mTOR信號傳導和蛋白翻譯調控等途徑。這表明，癌細胞對GSI的耐藥性可能通過抑制mTOR信號傳導或蛋白合成來實現逆轉。 圖2 GSI耐藥細胞系在蛋白和磷酸化修飾水平的變化 3. GSI獲得性耐藥模型中的分子調控特征 比較GSI敏感DND-41親代細胞（parental cells）及其衍生的耐藥細胞株（persister cells）蛋白表達差異發現，Myb、Brd4、cMyc等主調控因子在耐藥細胞株中上調表達，其他上調表達的蛋白還參與活性氧清除、氧化呼吸、蛋白合成等，這些與固有耐藥細胞系的情況相似。利用PDX模型篩選的耐藥細胞系 （PDTALL11、PDTALL19） 也出現了相似的改變。 圖3 獲得性耐藥細胞系的蛋白和磷酸化修飾差異 4. 激酶-底物富集分析（KSEA）找到關鍵的耐藥調控途徑 為了找到共同的調控方式，研究者利用KSEA算法分析了3種模型下GSI耐藥和敏感細胞中存在的激酶-底物調控模式，結果發現Akt1、PKC家族等激酶顯著富集，在耐藥細胞系中十分活躍。進一步實驗證實三個耐藥模型中的PKCδ在蛋白水平和磷酸化水平均上調表達，且表達水平與核糖體S6蛋白磷酸化水平正相關。用PKCδ的抑制劑處理后，細胞系中S6磷酸化水平顯著下調。 圖4 激酶PKCδ在耐藥細胞系的調控作用 5. 同時抑制Notch和PKC降低了耐藥T-ALL細胞的存活率 進一步實驗發現Notch通過cMyc正調控S6蛋白功能，促進細胞蛋白合成。在藥物敏感細胞系中，GSI 抑制Notch活性進而下調S6蛋白；而在耐藥細胞系中，PKCδ活性異常升高，促進S6蛋白的磷酸化從而解除了GSI所抑制的蛋白合成，形成細胞耐藥性。作者對耐藥細胞系中同時加入Notch的抑制劑GSI和PKCδ的抑制劑sotrastaurin，結果證實，聯合用藥顯著抑制了耐藥細胞的生長，并促進了耐藥細胞的凋亡。這說明抑制PKCδ活性可以恢復耐藥細胞對GSI的敏感性。 小編小結
實驗方法簡介
研究結果
圖5 Notch和PKC聯合抑制效果
腫瘤治療已經有了長足進步，針對一些關鍵驅動基因已經有了很好的靶向藥物治療，但腫瘤細胞對藥物的耐藥性是目前所面臨巨大挑戰。在腫瘤形成過程中可能存在固有耐藥性，在治療過程中則可能產生獲得性耐藥。本研究比較T-ALL腫瘤在不同條件下產生的對靶向藥物GSI的耐藥性模型，通過蛋白組學和DIA磷酸化修飾組學系統分析，找到了這些模型共通的耐藥分子響應特征，利用激酶-底物富集分析發現了關鍵激酶PKCδ及其調控靶點S6核糖體蛋白，解析了耐藥機制，最終發現了新的腫瘤治療靶點和更有效的聯合療法，為克服T-ALL治療中GSI耐藥性提供了可能。
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Nat Commun（IF:14.919） | 雙管齊下，讓癌細胞插翅難逃！DIA磷酸化助力發現T-ALL白血病新藥靶
作者：上海中科新生命生物科技有限公司 2021-12-23T19:16 (訪問量:1957)
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