圖?磁珠吸附DNA原理示意圖

操作篇

受益于高通量測序技術的發展，磁珠也憑借其高通量，適用于自動化的特點備受推崇，廣泛用于NGS文庫構建中DNA純化/雙輪分選（片篩）。

DNA純化的目的在于去除不想要的片段，由于磁珠優先吸附大片段，因而可通過一定比例的磁珠吸附特定大小以上的片段，丟棄上清（去除非目標片段）后將磁珠吸附的DNA洗脫回收。常用于小片段如接頭二聚體/引物二聚體的去除。

圖?DNA純化操作示意圖

DNA雙輪分選（片篩）目的在于從片段化DNA中選擇特定區域的DNA片段大小。由于磁珠優先吸附大片段，因而需通過兩輪磁珠操作進行分選。以分選450-550?bp的片段范圍為例：首先第一輪磁珠吸附550?bp以上片段，此時棄磁珠留上清，則上清中片段為550?bp以下的片段。第二輪取磁珠吸附450?bp以上（550?bp以下）磁珠，此時棄上清，再將磁珠上的目的片段洗脫回收。常用于NGS文庫構建片段分選（片篩）。

圖?DNA雙輪分選操作示意圖

結果分析篇

1.?磁珠回收效率

DNA樣本經磁珠純化后會有部分樣本的損失，磁珠回收效率可評估磁珠的回收能力。具體可通過計算得出：回收效率=（純化后的DNA質量/Input?DNA質量）×100%。

以下表為例，相同的比例條件下：測試人1測試A樣本回收效率=153.25/169.5=90.41%，同理可計算其他樣本的回收效率。

表?磁珠回收效率計算

【注】：磁珠測試數據來源于上海某生物公司,?表格中A為AMPure?XP磁珠；B、C、D分別是翊圣磁珠三個不同批次。

2.?磁珠分選精度

由于二代測序段短讀長的局限性，因而最終的NGS文庫需滿足一定的長度要求。因而NGS建庫中可能會分選特定長度區間的片段，滿足上機需求。分選精度則是評估不同的磁珠投入比例分選得到的片段大小。一般以Agilent?2100儀器檢測。

在特定磁珠比例（0.45×/0.15×）條件下，不同樣本分選后片段分布范圍集中在同一位置。較好的分選效果圖應該是頂部窄而圓潤的獨峰。

【注】：數據結果來源于上海某生物公司。值得注意的是：不同廠家磁珠buffer的不同，導致相同比例條件下分選得到的片段范圍也不一致，使用前請按照對應的磁珠說明書選擇合適的分選比例進行操作。

注意事項篇

1.?磁珠使用前需平衡至室溫，否則影響實驗效果（PEG分離效果易受pH、溫度等影響）；

2.?用于磁珠洗脫的80%無水乙醇需現用現配；

3.?長度分選時建議初始體積≥100?μL，不足時請用超純水補齊（樣品體積太小，將導致移液誤差增大，進而影響分選的準確性）；

4.?磁珠分選時特別注意第一輪分選后棄含大片段的磁珠，第二輪棄含小片段的上清；

5.?第一輪分選轉移上清時，避免吸到磁珠，引起大片段殘留；

6.?分選/純化產物如需長時間存放請用TE?buffer洗脫保存。

FAQ篇

看起來很簡單的純化/分選實驗，卻在實際實驗中有各種意外的情況。那關于產品選擇以及使用方面我們實際操作中有什么需要注意的事項呢？

產品應用：

1.?磁珠可以吸附ssDNA嗎？

A：可以回收單鏈DNA，具體性能沒有測試過。附圖是Beckman磁珠回收單鏈DNA的數據，可以作為參考。

2.?分選磁珠可以純化gDNA嗎？

A:翊圣分選磁珠測試過最大20kb的片段，回收率>90%?；蚪M?DNA?未測試過，測試時，由于大DNA與磁珠結合的非常緊，建議盡量增加洗脫液體積，避免干燥時間過久。

3.?磁珠的DNA結合能力怎么樣？

A：在目前的磁珠體系中，磁珠的吸附能力均為過飽和，客戶不必擔心磁珠結合能力不足的情況。根據已知的報道，每1?μL磁珠可以結合7?μg?DNA。

4.?使用磁珠吸附小片段的時候，大片段也會吸附上來嗎？

A:?磁珠優先吸附大片段，增大磁珠投入量時，磁珠會在吸附大片段的基礎上增強吸附小片段的能力。舉例說明：

參考磁珠純化分選表，100 μL樣本，加入80 μL磁珠Cat#12601,此時磁珠上吸附的是>350 bp的片段，但是，當磁珠投入量至100 μL時，磁珠上吸附的是>200 bp的片段。

產品使用效果：

1.?使用磁珠分選/純化之后，還有小片段殘留是怎么回事？

A:?小片段殘留大部分是接頭二聚體/引物二聚體。若純化，降低磁珠比例；若分選：可適當降低二輪磁珠比例可有效改善此類情況。

2.?磁珠回收率低可能的原因是什么？