編者按
近日，基孔肯雅熱疫情在全球多地擴散，已有119個國家報告病例，約550萬人面臨感染風險。基孔肯雅熱由基孔肯雅病毒(CHIKV)引起，作為一種主要經伊蚊叮咬傳播的病毒性傳染疾病，可引起嚴重的關節疼痛、神經系統并發癥等。一直以來，人類對基孔肯雅病毒的研究都從未止步。
本期，我們特別回顧一篇由法國巴斯德研究所研究團隊發表在病原體生物學頂刊《PLoS Pathogens》上的一項研究成果，該研究首次建立了斑馬魚模型，利用其胚胎通體透明等特性實現了基孔肯雅病毒（CHIKV）感染過程的全身實時可視化，并明確了中性粒細胞在抗病毒應答中的核心地位，揭示了CHIKV的傳播機制和宿主免疫應答，為理解CHIKV致病機制及開發靶向療法提供了全新視角。
斑馬魚作為唯一能實現全身感染動態可視化的脊椎動物模型（斑馬魚模型丨環特抑菌/抗病毒功效評價模型一覽），在感染性疾病研究與新藥研發領域的應用日益廣泛，如何有效終結基孔肯雅病毒持久性感染，正從斑馬魚透明的軀體中透出曙光。
01、斑馬魚：破譯感染的理想模型
基孔肯雅病毒(CHIKV)，是一種可能引發嚴重疾病的重新出現的蟲媒病毒，對全球公共衛生安全造成了重大威脅，但CHIKV在體內的傳播、細胞嗜性及宿主先天免疫反應的動態過程尚不清晰。如何在活體中實時觀察病毒感染的動態過程？傳統的小鼠等哺乳動物模型盡管能部分模擬人類疾病，但無法進行活體全身水平的感染動態、宿主抗病毒/炎癥反應的可視化觀察。而斑馬魚的特性，使其成為解決這一難題的完美載體。
斑馬魚看似與人類迥異，但擁有約87%的人類基因同源性，且胚胎透明，非常適合體內成像。其具有類似哺乳動物的先天和適應性免疫系統，更重要的是，出生后一個月內的斑馬魚僅依賴先天免疫系統(髓系細胞:中性粒細胞和巨噬細胞)，這正是研究病毒早期入侵機制的理想窗口。
其擁有I型干擾素(IFN1-4)，其中IFNФ1和IFNФ3在幼魚中起主要作用。當研究人員向3天大的斑馬魚靜脈注射表達綠色熒光蛋白（GFP）的基孔肯雅病毒（CHIKV-GFP），短短14小時內，病毒在肝臟、肌肉、鰓部、腦部等多個器官同時點亮感染細胞，形成一波感染高潮。與哺乳動物類似，CHIKV感染會觸發強烈的Type-l干擾素(IFN)反應，進一步實驗表明，嗜中性粒細胞在控制CHIKV方面發揮著關鍵的作用。
綜上所述，本研究結果表明，斑馬魚是一種新穎的、有價值的動物模型，可用于動態可視化人類病毒的復制、致病過程以及宿主的反應。（斑馬魚模型丨環特抑菌/抗病毒功效評價模型一覽）
02、主要研究成果
1. 構建斑馬魚基孔肯雅病毒模型，首次實現全身實時感染可視化觀測
本研究通過靜脈注射CHIKV-115或CHIKV-GFP(表達GFP的CHIKV)成功構建了3日齡(dpf)的斑馬魚基孔肯雅病毒感染模型，首次在斑馬魚中實現細胞分辨率的全身病毒感染動態成像。
實驗結果顯示，CHIKV病毒在斑馬魚中有效復制（病毒滴度>10? TCID50/g組織），感染性病毒顆粒在感染后24-48小時達到峰值，其病理特征與哺乳動物相似。qPCR檢測結果表明，病毒E1基因和GFP轉錄本的動力學與病毒滴度一致。
圖1
2. 斑馬魚CHIKV感染動態圖譜揭示病毒擴散與組織特異性
研究人員利用GFP標記發現CHIKV-GFP感染了多種器官。感染初期病毒廣泛分布于肝臟、肌肉、血管等器官，后期向腦部集中（圖1D-E），且在頜骨、鰭、肝臟、血管、肌肉等多數器官中，感染細胞數量于1-2 dpi達到峰值，隨后迅速下降。
通過追蹤單個感染細胞從出現到死亡的全過程發現，感染細胞在注射后14小時（中位時間）集中出現，肝臟細胞平均存活27小時，腦細胞存活>72小時，死亡時間因器官而異。通過繪制感染動態圖譜可見，感染細胞呈"單波次"出現（88%在24小時內），死亡呈器官依賴性。
腦部感染細胞存活時間顯著延長，表明大腦可能是病毒持久性儲存庫（圖2F），這與人類嬰兒CHIKV腦炎病例相關。與大多數器官不同，腦實質中的感染在2 dpi出現，并持續至少至5 dpi，甚至在7 dpi仍可見強感染。固定樣本的IHC染色也證實了這一廣泛的感染模式。
圖2
圖3
3. I型干擾素（IFN）的關鍵作用
隨后，研究人員基于斑馬魚模型發現，CHIKV感染會觸發強烈的IFN-φ1/φ3反應（圖4A-C）。CHIKV感染誘導的斑馬魚I型IFN基因 inb1、ifnb3和IFN刺激基因viperin的表達水平明顯高于以往報道的魚類病毒。
敲除IFN受體（CRFB1/2）或信號分子MAVS，導致病毒載量增加100倍、死亡率>90%（圖4D-F），表明IFN通路是生存必需。 敲低MAVS會減少inb1 和 viperin 的表達，而敲低IFN受體則不影響 ifnb1 但阻斷 viperin 表達?？傊?，I型IFN信號通路對控制CHIKV復制和病理至關重要。
圖4
4. 免疫機制新發現：中性粒細胞是主要IFN生產者
研究人員通過轉基因斑馬魚（ifnφ1:mCherry）結合FACS分選驗證，發現中性粒細胞是CHIKV感染后產生IFN的主要白細胞類型。將中性粒細胞進行雙重轉基因驗證，實驗結果顯示，80%的IFN-φ1+白細胞為中性粒細胞，其形態、分布、運動速度及顆粒特征等均與中性粒細胞相符。
感染后，mCherry+中性粒細胞數量在48 hpi顯著增加，并維持高水平至至少96 hpi。敲低IFN受體(CRFB1+2 MO處理)，阻止了中性粒細胞數量的增加。特異性敲低中性粒細胞csf3r MO或nos2a MO會顯著增加死亡率和病毒載量。這表明，CHIKV感染引起的中性粒細胞數量增加是依賴于宿主IFN反應的。
進一步的細胞消融實驗發現，中性粒細胞在控制CHIKV感染中起著至關重要的作用；肝細胞是第二IFN來源，但抗病毒作用較弱，而巨噬細胞消融對存活影響較小，這挑戰了傳統認知，并證實了中性粒細胞的關鍵作用?？傊?，"中性粒細胞-IFN軸"是抗CHIKV核心防線，為抗病毒策略提供了新靶點。
圖5
?圖6
目前，環特生物依托于國際領先的“斑馬魚、類器官、哺乳動物、人體”多維生物技術服務平臺，構建了抑菌、抗病毒等200多種功效與安全性評價模型，為廣泛科研場景下的各類需求，提供“活體顯微鏡”級的、流程化、體系化的病毒感染機制解析、藥物篩選研發、功效驗證等技術服務解決方案。（詳情請點擊：斑馬魚模型丨環特抑菌/抗病毒功效評價模型一覽）
03、編者點評
本研究首次動態可視化實現了在斑馬魚中以單細胞分辨率實時觀察病毒感染的發生和發展，并將斑馬魚確立為研究CHIKV發病機制的新模型，其病毒傳播過程與哺乳動物相似，為深入理解病毒與宿主相互作用、開發新療法提供了強大的工具。此外，研究還揭示了中性粒細胞不僅是干擾素的主要生產者，更是控制CHIKV感染的關鍵防線，這一發現徹底顛覆了中性粒細胞僅是“炎癥士兵”的傳統認知。
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參考文獻：Nuno Palha,Florence., Jean-Pierre. et al. Real-Time Whole-Body Visualization of Chikungunya Virus Infection and Host Interferon Response in Zebrafish. PLoS Pathogens9(9): e1003619 (2013) .doi.org/10.1371/journal.ppat.1003619