腫瘤壞死因子(TNF)通路是一個高度依賴蛋白質磷酸化調控的重要的促炎信號通路。臨床上，靶向TNF在治療炎癥方面非常成功，但抗炎療法可能會引起嚴重的副作用。由于TNF相關磷酸化調控網絡未得以全面剖析，因此亟需更系統的方法深入了解其中激酶、磷酸酶、底物關系及其信號轉導動力學變化，為藥物干預提供靶點，幫助更精確地控制疾病。 今年10月，蛋白組學領軍大牛Matthias Mann教授團隊在Nature Communications上發表了題為 “Phosphoproteome profiling uncovers a key role for CDKs in TNF signaling”的論文，利用高深度的DIA磷酸化蛋白質組學深入解析了TNF下游的信號轉導變化，從功能上探討了TNF及其誘導的細胞死亡中蛋白磷酸化變化，并揭示了CDK激酶在其中的關鍵調控作用，為抗炎治療等提供潛在藥物干預靶點。 技術路線 步驟1：通過DIA磷酸化組學，比較TNF處理不同時間磷酸化水平的變化； 步驟2：抑制關鍵激酶并揭示激酶和底物的關系； 步驟3：分離細胞膜、細胞核和細胞質，通過組學研究TNF誘導的磷酸化引起的蛋白易位； 步驟4：研究TNF誘導的細胞死亡中蛋白和磷酸化水平的變化； 步驟5：抑制CDK激酶，通過蛋白組學研究CDK的作用。 研究結果 1. TNF誘導磷酸化水平隨時間變化，可區分早期和晚期信號轉導活動 為系統描繪TNF相關磷酸化變化網絡，對TNF處理不同時間后U937細胞進行DIA磷酸化蛋白質組學分析，共鑒定到28,000條高可信度的磷酸化肽段。結果顯示，磷酸化水平在處理3min后顯著上調，15min達到峰值，大多數在60min后恢復到基線水平(圖1d,e,f)。進一步分析表明，許多參與NF-κB、模式識別信號通路為瞬時變化修飾蛋白，少數轉錄相關蛋白為較為持久修飾蛋白，其磷酸化在TNF刺激后60分鐘仍保持上調 (圖1f)。綜上，可根據蛋白磷酸化變化時序區分早期(5分鐘)、中期(15分鐘)、晚期(60分鐘)信號活動。 圖1 TNF調控下不同時間的磷酸化信號活動 2. TNF刺激下的激酶-底物關系分析 為進一步揭示激酶-底物關系，使用特定抑制劑去抑制關鍵激酶活性，并進行磷酸化組學分析。結果表明，對于通過激活NF-κB等上游通路的激酶而言，如TAK1，其活性抑制后幾乎消除了TNF相關的磷酸化變化(圖2c)。相反，抑制下游激酶如IKK1/2、p38、MEK1/2和JNK則不能完全消除TNF作用(圖2c)。進一步在STRING網絡中分析激酶與底物關系，發現在TNF刺激下磷酸化的蛋白質并未與其他磷酸化蛋白緊密相關 (圖2d)。同時，有些蛋白不受TAK1抑制影響，但受到IKK1/2抑制的強烈影響(圖2e)，表明IKK1/2發揮了一些不依賴于TAK1活性的功能。總之，該分析全面揭示了TNF刺激下的激酶與底物關系。 圖2 TNF刺激下的激酶-底物關系 3. TNF相關磷酸化引發蛋白質重新定位 TNF相關磷酸化變化依賴于激酶及其底物的重新定位。為了分析該現象，比較TNF處理后，細胞膜、細胞核和細胞質中的蛋白及磷酸化變化，從而評估蛋白質定位變化 (圖3a)。結果顯示，NF-κB通路、轉錄相關蛋白質等很多蛋白質發生定位變化（圖3d,e, f）。富集分析顯示，RIG-I通路、RNA加工體組裝的蛋白質在膜上發生磷酸化變化，而模式識別受體信號通路和細胞遷移通路中的磷酸化在細胞質基質中發生變化(圖3h)，且其中多數能被TAK1抑制劑阻礙，暗示其受細胞質中TAK1 活性調控(圖3g)。 圖3 TNF誘導的磷酸化影響TAK1下游信號通路成員的定位變化 4. TNF誘導的細胞死亡觸發強烈的RNA加工響應和CDK激活 為分析TNF誘導細胞死亡中關鍵調控的磷酸化蛋白，對TNF處理的U937細胞添加細胞凋亡和壞死抑制劑（SM、IDN-6556）誘導細胞死亡，并進行磷酸化組學分析 (圖4b)。結果表明，RNA剪接和mRNA加工的蛋白磷酸化在凋亡過程中顯著上調(圖4c)。進一步分析及驗證發現，該過程受到細胞周期蛋白依賴激酶CDKs的磷酸化變化調控，CDKs通過調節RNA聚合酶II活性來調節轉錄過程, 其中，CDK9 T354位點的磷酸化在TNF處理后上調9倍(圖4c-i)。 圖4 TNF誘導的細胞死亡導致強烈的RNA加工響應及CDK激活 5. TNF靶基因的轉錄依賴于CDK激酶活性 TNF能誘導廣泛的靶基因轉錄表達，而上述分析中已發現CDKs通過調節RNA聚合酶II活性調控轉錄。為進一步解析CDKs活性變化是否影響TNF誘導的靶基因表達。采用不同CDKs抑制劑處理TNF刺激的U937細胞，并進行蛋白質組分析，發現CDK激酶活性抑制后幾乎消除了TNF誘導的蛋白質表達變化(圖5a-5b)。隨后，又驗證了相關靶基因CCL2 (MCP1)和CXCL10 (IP10)mRNA水平變化，發現同樣下調(圖5d)，說明該過程確實發生在轉錄水平上。綜上表明，CDKs激酶活性變化調控TNF靶基因的轉錄。 小結 中科優品推薦 磷酸化修飾是生物體內最普遍的一種修飾，研究方法眾多，【中科新生命】可提供4D-labelfree、TMT、DIA多種技術方法的磷酸化組學檢測。其中DIA磷酸化可實現超高深度的檢測，覆蓋度及準確性都有顯著提升。歡迎感興趣的老師前來咨詢。
圖5 CDK9和CDK12/13抑制劑影響TNF靶基因的轉錄
本研究通過DIA磷酸化蛋白質組學與亞細胞定位和激酶抑制劑分析相結合，深入分析了TNF受體下游的信號事件，闡明了數千個磷酸化事件的動力學、激酶底物關系和定位變化，提示了針對不同轉錄的CDKs的抑制劑可以作為抗炎劑或腫瘤細胞殺傷劑，深入全面的磷酸化水平的數據為后續研究提供了寶貴資源。
Nat Commun（IF 14.9）| 組學領軍大牛Matthias Mann利用DIA磷酸化組深度剖析促炎信號通路
作者：上海中科新生命生物科技有限公司 2021-12-30T18:51 (訪問量:3801)
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