編者按

非酒精性脂肪性肝?。∟AFLD）是非酒精性脂肪性肝炎、肝纖維化、肝硬化以及潛在肝細胞癌的主要病因。野菊花（Chrysanthemum indicum）作為一種傳統的食藥同源植物，在中國已有超過2000年的應用史。然而，關于野菊花在非酒精性脂肪性肝病治療中的作用很少被研究。

今天，我們分享由澳門大學中醫研究所張慶文、林理根研究團隊發表在J Adv Res.（IF=11.4）的一項最新研究成果。該研究旨在揭示野菊花治療NAFLD的新型活性成分及其潛在機制的，結果表明：野菊花新型倍半萜類化合物通過減輕SIRT1介導的脂質積累和鐵死亡來緩解肝臟脂肪變性，為進一步開發治療NAFLD的候選藥物提供了強大工具。

研究人員在基于MS/MS的分子網絡指導下，從野菊花中分離得到27個新型二聚倍半萜類化合物——chryindicolides A-Z (1-26) 和 chrysanthemolide C (27)，以及7個已知化合物。其中，化合物1-7為罕見的含氯愈創木內酯二聚體；Chryindicolide O (15) 能直接結合并激活去乙酰化酶Sirtuin 1 (SIRT1)，從而在棕櫚酸和油酸（P/O）誘導的AML12肝細胞中減少脂質新生、增強脂肪酸β-氧化并抑制鐵死亡；Chryindicolide O也顯著改善了高脂飲食喂養的斑馬魚肝臟脂肪變性。

文章題目

Dimeric guaianolide sesquiterpenoids from the flowers of Chrysanthemum indicum ameliorate hepatic steatosis through mitigating SIRT1-mediated lipid accumulation and ferroptosis

雜志：J Adv Res.（IF=11.4）

發表時間：2025年1月7日

作者：張慶文、林理根等

單位：澳門大學中醫研究所等

01、研究亮點

• 從野菊花中靶向分離出 27種新型二聚倍半萜化合物——chryindicolides A-Z及chrysanthemolide C），其中化合物1-7為罕見的含氯愈創木內酯二聚體；

• Chryindicolide O可改善肝細胞和斑馬魚的肝脂肪變性，其作用機制明確；

• Chryindicolide O直接結合并激活去乙?；窼irtuin 1（SIRT1）；

• Chryindicolide O抑制脂質新生（DNL），增強脂肪酸β-氧化（FAO）；

• Chryindicolide O抑制SIRT1介導的鐵死亡。

摘要

02、研究背景

非酒精性脂肪性肝?。∟AFLD） 是全球最常見的肝臟疾病，影響著全球約四分之一的人口。肝細胞中異位脂質的積累及其后續的脂毒性明顯加速了NAFLD的進展。因此，減輕肝細胞內的脂質積累成為非酒精性脂肪性肝病治療的一種可行策略。

肝臟脂質代謝的調控涉及脂質新生（de novo lipogenesis, DNL） 和脂肪酸β-氧化（fatty acid β-oxidation, FAO）等多個過程。DNL即利用膳食來源物質來生產內源性合成脂質。人體同位素標記研究表明，NAFLD患者的DNL比非酒精性脂肪性肝病患者的DNL對肝臟甘油三酯（TG）的積累高三倍。FAO是脂肪酸降解的主要途徑，線粒體中FAO的損傷不僅導致肝細胞內脂質積累，還會通過活性氧（ROS）釋放和氧化損傷引發炎癥，從而加重NAFLD的發展。因此，減少DNL和增強FAO是減輕肝臟脂質積累的有效策略。

鐵死亡（Ferroptosis）作為一種獨特的細胞死亡形式，依賴于鐵介導的芬頓反應（Fenton reaction），促進自由基和ROS的生成。鐵過載和脂質過氧化通常被認為是鐵死亡的主要特征。在NAFLD的初始階段，肝臟鐵水平和氧化應激顯著升高，甚至比典型的NAFLD指標，如肝臟脂肪酸堆積、胰島素抵抗等提前兩周。另一項生物信息學研究也揭示了肝臟脂肪變性的進展與多個鐵死亡相關基因，如酰基輔酶A合成酶長鏈家族成員3 (ACSL3)、脂肪酸去飽和酶2 (FADS2) 、醛酮還原酶家族1成員C1 (AKR1C1)）。

多不飽和脂肪酸（PUFA） 通常被認為是脂質過氧化的主要底物，脂質過氧化導致長鏈PUFA（LCPUFA）的消耗，如ω-3和ω-6 LCPUFA。ω-3 LCPUFA的減少可能通過刺激肝臟DNL和抑制肝臟FAO來增強肝臟脂肪變性。此外，脂質ROS通過增加脂滴的形成來增強肝臟脂肪變性，而清除鐵死亡相關的脂質過氧化物則有助于減少脂質積累。因此，抑制鐵死亡有助于恢復肝細胞內的鐵穩態，并抑制非酒精性脂肪性肝病的發展。減少脂質積累和抑制鐵死亡是非酒精性脂肪性肝病相關癥狀治療的有效途徑。

越來越多的證據表明，天然產物，尤其是萜類化合物，能夠有效緩解NAFLD的相關癥狀，是治療非酒精性脂肪性肝病的有潛力的候選藥物。野菊花作為一種藥食同源草本植物，在中國、日本和韓國等地已有超過2000年的廣泛應用史。作為一種傳統中藥，野菊花具有清熱解毒、瀉火、平肝等多種特性。現代藥理學研究已證明其具有抗炎、抗癌、抗氧化、保肝和抗菌作用等廣泛的生物活性。此外，野菊花也是一種受歡迎的營養健康補充劑，因其對治療潰瘍、癰瘡、眼睛腫脹、頭痛和頭暈有效，而被用于湯、飲料和茶中。先前的研究發現，野菊花的乙醇和乙酸乙酯提取物可減輕高脂飲食喂養的小鼠肝臟脂肪變性。然而，野菊花在治療非酒精性脂肪性肝病中的有效成分及其潛在機制尚不清楚。

倍半萜類及其聚合物因其結構復雜性和多樣的生物活性，如抗癌、抗炎、抗肥胖、抗糖尿病、抗病毒和抗瘧活性等而引起了越來越多研究者的興趣。最近的研究強調了倍半萜類二聚體在菊科（Asteraceae）和金粟蘭科（Chloranthaceae）中普遍存在，其中愈創木烷型（guaiane-type）倍半萜類二聚體主要分布在菊科。目前，愈創木內酯二聚體主要是從蒿屬（Artemisia）植物中鑒定出來，其中僅有大約15 種愈創木內酯二聚體是從野菊花（C. indicum）中分離出的。

全球天然產物分子網絡（GNPS）已成為一種強大的工具，能夠基于樣品的UPLC-MS/MS譜圖，從多個樣品中生成分子網絡。其利用結構相關分子在MS/MS 譜圖中的相似性創建而成，有助于闡明已知化合物及發現新的類似物。因此，本研究采用分子網絡引導策略對野菊花進行了全面的植物化學研究，并鑒定了27種新型倍半萜類化合物，還評估了這些分離得到的化合物在治療肝脂肪變性中的作用及其潛在機制。

03、研究結果

1. 基于MS/MS的分子網絡構建

研究人員將野菊花95%的EtOH提取物分為PE、EtOAc、n-butanol和H2O組分，掃描獲得每個組分的UPLC-MS/MS譜圖，將其導入GNPS生成分子網絡?；贛S/MS的分子網絡指導下，從野菊花中分離得到27個新型二聚倍半萜類化合物——chryindicolides A-Z (1-26) 和 chrysanthemolide C (27)（圖1）；并通過光譜解析了化合物1–27的結構，鑒定了化合物1-7為罕見的含氯愈創木內酯二聚體，確定了愈創木內酯倍半萜類化合物的兩種二聚化模式。

圖1

2. Chryindicolide O抑制脂質新生（DNL），增強脂肪酸β-氧化（FAO）

P/O 溶液誘導的肝細胞脂質積累模型常被用于NAFLD體外研究。研究人員采用MTT法評估化合物對AML12肝細胞的細胞毒性，確定最大安全濃度后，對分離得到的化合物在P/O誘導的AML12細胞中進行了降脂作用研究。尼羅紅染色結果顯示，20種化合物在最大安全濃度下表現出降脂作用，其中，化合物10、13、15、23、29和30改善脂肪變性作用顯著；其余14種化合物在最大安全濃度下，抑制率均小于50?%。

作為最有效的化合物，Chryindicolide O(15)被選作研究對象，尼羅紅和BODIPY染色結果表明，化合物15(2.5、5、10?μM)在P/O誘導的AML12細胞中，劑量依賴性地降低了脂質積累，且15以濃度依賴的方式降低了P/O誘導的AML12細胞中甘油三酯(TG)、總膽固醇(T-CHO)和非酯化脂肪酸(NEFA)的含量。肝臟DNL在肝臟脂肪變性中起著重要作用。固醇調節元件結合蛋白(SREBPs)是調控DNL通路相關基因的關鍵轉錄因子，在NAFLD的發生發展中發揮著重要作用。結果顯示，15降低了ACLY、ACC、FASN和SCD1的蛋白水平?；衔?5能夠有效促進FoxO1的去乙?；?，抑制SREBP1的蛋白表達和核轉位，從而降低DNL。

隨后，研究人員檢測了化合物15對FAO相關蛋白表達的影響，P/O誘導降低了CPT1A的表達，而化合物15明顯逆轉了這一變化，依賴性地促進了PPARa的總蛋白和核蛋白水平。P/O誘導降低了AML12細胞中PGC-1q的蛋白表達，促進了PGC-1q的乙酰化，表明PGC-1q活性受損。而用15處理后，PGC-1G的蛋白表達明顯增加，乙?；浇档?。免疫共沉淀分析表明，化合物15處理后PPARα沉淀的PGC-1α量增加，表明15促進了PGC-1α與PPARG的結合。綜上，化合物15促進了PGC-1q的表達和去乙酰化，從而促進其與PPARG的結合，并增強其轉錄效應以增加CPT1A的表達，導致FAO增加、脂質積累減少。

圖2

3. Chryindicolide O直接結合并激活SIRT1

Sirtuin 1(SIRT 1)是一組III型的蛋白脫乙酰酶，被認為是新的參與細胞衰老和炎癥調節的抗衰老蛋白，通過去乙?；幌盗械孜?，在對抗NAFLD的進展中起著至關重要的作用。P/O處理降低了SIRT1的蛋白表達，而化合物15處理逆轉了這種變化。DARTS證實了化合物15對鏈霉蛋白酶誘導的SIRT1蛋白降解的抑制作用，且化合物15與SIRT1直接結合。結果顯示，與vehicle組相比，化合物15減弱了SIRT1的降解。分子對接結果表明，化合物15是SIRT1的潛在激活劑?？傊?，化合物15直接與SIRT1的SBD結合和激活SIRT1，并通過抑制泛素依賴性蛋白降解來促進SIRT1蛋白表達。

此外，通過尼羅紅染色和BODIPY染色評估發現，EX-527處理使P/O誘導的 AML 12肝細胞脂質含量更高，并消除了15對脂質積累的抑制作用，E且X-527逆轉了化合物15對甘油三酯（TG）、總膽固醇（T - CHO）和非酯化脂肪酸（NEFA）含量的降低作用。WB和免疫熒光圖像結果顯示，EX-527處理消除了15減少FoxO1乙?；⒃黾覨oxO1在細胞核內滯留的影響，并顯著增加了SREBP1蛋白水平和細胞核內滯留。通過PGC-1α/PPARα/CPT1A 信號通路，發現EX-527幾乎消除15增加CPT1A 蛋白表達的作用。這表明，化合物15通過直接結合和激活SIRT1來減少肝細胞中的脂質積累。

圖3

4. Chryindicolide O抑制SIRT1介導的鐵死亡

研究中，在P/O暴露的AML12細胞中，化合物15使GPX4蛋白水平呈濃度依賴性增加，并伴隨FoxO1核轉位增加。為進一步證明化合物15通過抑制鐵死亡保護肝細胞，通過檢測相關生化指標發現，P/O處理增加了細胞內鐵死亡的顯著特征脂質過氧化和ROS水平等，而化合物15明顯減弱了這些變化，且呈劑量依賴性，表明化合物15抑制了鐵死亡。EX-527處理還增加了P/O處理的肝細胞內的脂質過氧化和ROS水平燈，表明抑制SIRT1可能加重鐵死亡。

P/O處理后，谷甘肽(GSH)水平和SOD活性呈下降趨勢，而MDA水平升高，表明氧化還原系統受損；而在P/O誘導的AML12細胞中，化合物15處理導致GSH水平和SOD活性增加，而MDA降低，EX-527取消了這一作用。化合物15處理也降低了P/O處理的肝細胞中的線粒體ROS(mtROS)，增加了P/O誘導的AML12細胞中的Fe²?含量、線粒體含量、ATP含量等?？傊赑/O處理的AML12細胞中，化合物15通過SIRT1降低脂質過氧化及Fe²?含量，并通過SIRT1改善線粒體含量和功能來緩解鐵死亡。

圖4

5. Chryindicolide O可減輕高脂飼料喂養的斑馬魚肝臟脂肪變性

隨后，研究人員構建了斑馬魚NAFLD模型，利用高脂飼料喂養的斑馬魚證實了化合物15對NAFLD的抑制作用。實驗結果顯示，斑馬魚體重顯著降低，正常斑馬魚肝臟組織形態正常，有完整且排列緊密的肝細胞空泡，HFD組肝細胞空泡多、肝細胞變形且排列不規則，而化合物15處理后肝臟空泡更小、更少。

油紅O染色表明化合物15處理后的斑馬魚肝臟脂滴減少，甘油三酯（TG）、總膽固醇（TCHO）、非酯化脂肪酸（NEFA）水平及谷丙轉氨酶（ALT）、谷草轉氨酶（AST）活性顯著降低。且15處理后也降低了活性氧（ROS）和丙二醛（MDA）含量，增加了谷胱甘肽（GSH）水平和超氧化物歧化酶 2（SOD2）活性，這表明15對NAFLD的抑制作用，緩解了高脂飼料喂養的斑馬魚肝臟脂肪變性。

圖5

04、編者點評

本研究首次揭示了野菊花倍半萜類化合物通過SIRT1雙途徑——脂代謝與鐵死亡來改善脂肪肝，并闡明SIRT1-FoxO1/SREBP1與SIRT1-PGC-1α/PPARα/CPT1A通路串擾，及SIRT1-GPX4抗鐵死亡新機制，為天然抗NAFLD候選藥物提供了新來源，有望基于新化合物來治療NAFLD提供新策略。

作為健康美麗產業CRO服務開拓者與引領者、斑馬魚生物技術的全球領導者，環特生物搭建了“斑馬魚、類器官、哺乳動物、人體”多維生物技術服務體系，開展健康美麗CRO服務、科研服務、智慧實驗室搭建三大業務。目前，環特已建立200多種斑馬魚模型，胃癌、腦類器官、心臟類器官及各種腫瘤類器官培養平臺，歡迎有需要的讀者垂詢！