小細胞肺癌（SCLC）占肺癌的13%至15%，估計全世界有25萬癌癥死亡。雖然小細胞肺癌最初對化療和放療高度敏感，但治療耐藥性的發展基本上是普遍的。由于在治療后缺乏有效的后續治療方法，導致治療失敗。因此，迫切需要闡明小細胞肺癌耐藥的機制。
中山大學腫瘤防治中心陳明教授團隊通過比較治療敏感和耐藥SCLC腫瘤樣本的基因型和表型，研究了SCLC的治療耐藥機制，研究表明PI3K/AKT通路激活可能是小細胞肺癌治療耐藥的潛在機制之一。這一發現值得進一步研究，并為逆轉化療/放療耐藥性提供了一種可能的方法。相關研究結果以“Activation of PI3K/AKT Pathway Is a Potential Mechanism of Treatment Resistance in Small Cell Lung Cancer“為題發表在了Clinical cancer research期刊上（IF：13.801）。吉凱基因提供了本文FFPE樣本的label free蛋白質組學服務。
對11例接受CCRT治療配對的LS-SCLC初發和復發時的腫瘤樣本進行WES分析，觀察到放化療后的基因組變化富集在PI3K/AKT通路及存在克隆進化。公開數據庫及獨立ES-SCLC隊列的FFPE蛋白質組學進一步證實化療耐藥與PI3K/AKT通路的激活有關，并進一步通過體外實驗證實化療耐藥細胞株對PI3K抑制劑敏感，有望成為逆轉化療/放療耐藥性的潛在治療靶點。
研究結果
1. 初治與復發SCLC腫瘤的基因突變情況
研究者收集了11例接受CCRT治療的局限期小細胞肺癌（LS-SCLC）治療初期及復發的腫瘤組織樣本，共鑒定出4824個非沉默體細胞突變，包括SNV和indel，每個樣本的變體中位數為216個。結果表明，TP53和RB1的改變是原發性和復發性SCLC的突變特征。在該SCLC隊列中也發現了其他SCLC中的頻繁突變癌基因（24個）及先前報道在介導SCLC細胞系或其他惡性腫瘤的化療或放療抵抗中起著關鍵作用的多個突變基因。
2. 放化療后的基因組變化富集在PI3K/AKT通路
研究團隊比較了治療初期與復發SCLC腫瘤的基因組特征，以確定與CCRT后復發相關的基因組特征。在所有患者的2827個突變中，基線和復發樣本共同擁有1997個突變（71%），與非小細胞肺癌相似，但明顯高于乳腺癌和結直腸癌。復發腫瘤中發現了平均94%的治療初期的腫瘤突變。
最常見的復發特異性突變基因為RB1、PCLO、DNAH5、PRUNE2、SYNE1和TACC2。這些獲得性改變涉及多種途徑，尤其是PI3K/AKT途徑。11名患者中有8名患者的PI3K/AKT信號通路中富含20個獲得性突變的基因，其中16個基因位于該通路上游。
3. 放療下SCLC的克隆進化
接下來，研究團隊通過PyClone推斷治療初期和復發SCLC腫瘤的亞克隆結構，以描述放化療下的克隆進化。有趣的是，大多數共享突變（95%）顯示復發腫瘤的癌細胞分數（CCF）增加，包括714個突變CCF增加超過20%。此外，復發樣本中克隆的數量也顯著高于治療初始樣本，表明CCRT后出現新克隆?？偟膩碚f，治療初期腫瘤中的主要克隆在復發腫瘤中表現為主要克隆或次要克隆。
根據治療初期和復發腫瘤中克隆結構的變化，確定了兩種進化模式。第一種模式顯示，治療初期和復發腫瘤（患者N04、N05、N06、N07、N09和N10）中的主要克隆持續存在。第二種模式的特點是初治腫瘤的主要克隆減弱，然后繼續演變為兩種進化模式。具體而言，患者N01、N03和N11在治療初期腫瘤中一些次要克隆發展為復發腫瘤中的主要克隆。另一方面，患者N02和N08表現出新克隆的出現和快速擴展，成為復發性腫瘤的主要克隆。有趣的是，與模式1相比，模式2與更長的PFS相關。
4. 獨立的SCLC患者隊列和公共數據集驗證難治性SCLC中PI3K/AKT通路的激活
由于對與小細胞肺癌治療后復發相關的PI3K/AKT通路激活特別感興趣，研究團隊試圖在另外的患者樣本以及公開的小細胞肺癌數據集中驗證這些發現。
（1）首先，對另外9名接受CCRT治療的LS-SCLC患者的初始診斷和復發時的1021個癌癥相關基因（cfDNA）進行靶向測序。復發樣本56個基因攜帶獲得性突變或增加的CCF，也都富集在PI3K/AKT信號通路。（圖A）
（2）第二組獨立的28個化療耐藥和23個化療敏感的ES-SCLC的FFPE樣本。Label free蛋白質組學(由吉凱基因提供）被用于鑒定化療耐藥和化療敏感性SCLC之間差異表達的蛋白質，KEGG途徑富集分析表明，具有差異上調蛋白的基因（倍數變化>1.2）在WNT信號途徑、RNA降解、嘌呤代謝和HIF-1信號途徑中富集。由于PI3K/AKT通路在維持HIF-1a在各種惡性腫瘤中的轉錄、翻譯和生物活性方面發揮著關鍵作用，重新標記了62個PI3K/AKT信號通路基因，并從WES隊列中確定了拷貝數增加。有趣的是，HIF-1途徑涉及7個基因（AKT1、AKT3、BCL2、IL6R、PIK3CA、PIK3CB和RPS6），其中6個位于HIF-1上游。（圖B&C）
（3）一項12對治療初期與復發腫瘤的WES公開數據，分析發現882個基因攜帶復發腫瘤的獲得性突變，這些突變也富含PI3K/AKT信號通路?；诠矓祿斓木哂胁煌委煼磻腟CLC細胞系的轉錄組數據，GSEA差異表達通路分析顯示，PI3K/AKT通路和HIF-1通路在順鉑耐藥但對PI3K抑制劑敏感的細胞中顯著上調。
5. 體外驗證PI3K/AKT通路激活功能與小細胞肺癌治療耐藥相關
研究者進一步嘗試用一對化療敏感（H69）和化療耐藥（H69AR）SCLC細胞系驗證PI3K/AKT通路在小細胞肺癌治療耐藥性發展中的作用。首先評估了14個攜帶獲得性CNV基因的表達。與CNV分析一致，具有拷貝數增加的MYB、PI3KCA、HSP90AA1和BCL2上調，而具有拷貝數丟失的TP53在耐藥H69AR細胞中下調。此外，western blot評估PI3K/AKT途徑中的總蛋白以及關鍵基因的磷酸化形式，結果表明耐藥H69AR細胞中AKT及其下游靶點4EBP-1和p70S6的磷酸化增加。最后，對順鉑聯合或不聯合PI3K抑制劑處理的H69AR、DMS53和H446細胞進行了細胞活力測定。結果表明，順鉑與幾種PI3K抑制劑（包括BEZ235、BKM120和GSK2126458）之間存在協同效應。
WES分析表明LS-SCLC復發時，PI3K/AKT信號通路中的基因因獲得性體細胞突變或高頻獲得性CNV而富集。ES-SCLC隊列中差異蛋白的通路分析顯示HIF-1信號通路富集，并且62個含有獲得性體細胞拷貝數擴增的PI3K/AKT途徑基因中有7個在HIF-1途徑中富集。獨立的SCLC患者隊列和公共數據集證實化療耐藥SCLC細胞系中PI3K/AKT和HIF-1通路上調。此外，體外實驗表明，化療耐藥細胞株對PI3K抑制劑敏感。因此，以上研究表明PI3K/AKT通路激活可能是小細胞肺癌治療耐藥的潛在機制之一。這一發現值得進一步研究，并為逆轉化療/放療耐藥性提供了一種可能的方法。
吉凱助力
吉凱基因提供了本文FFPE樣本的label free蛋白質組學服務。
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