題目：Circ-ZNF609 is a circular RNA that can be translated and functions in myogenesis
期刊：Molecular Cell
影響因子：14.248
主要技術：RNA-Seq、CRISPR/Cas9、circRNA FISH
研究背景
環狀RNAs（circRNAs）是一個具有獨特結構的轉錄子家族，其大部分功能仍然是未知的。近幾年在探究circRNA的成環機制和調控機制中，越來越多的證據證明其在人類疾病中的潛在作用，且很大程度上與生物進程相關。
在本項研究中，作者發現circRNAs調控了小鼠和人類肌肉分化過程，且其表達量在杜氏肌營養不良（DMD）成肌細胞中發生改變。通過特定的基因敲除策略和高含量的表型篩選，初步確定circ-ZNF609參與控制肌生成的過程，并根據肌細胞增殖的調節能力，進一步發現與circRNA翻譯過程相關。
研究內容及結果
1. circRNAs在分化的哺乳動物成肌細胞中含量豐富、相對保守和高表達
本文采用在生長培養基（GM）中培養或誘導分化為肌管的人類和小鼠成肌細胞，提取總RNA后進行末端核糖核酸酶RNA序列分析（RNA-Seq），并通過FindCirc軟件檢測出circRNAs，結合qRT-PCR驗證RNA序列數據。數據顯示，在人類和小鼠樣本中均發現數千個環狀剪接事件，通過基因組的注釋和編碼區域的結構注釋發現，幾乎有90%來自于編碼蛋白質的基因內外顯子（圖1B），近10% circRNAs相對于線性RNA呈現出高度表達狀態。韋恩圖顯示出在人類和小鼠中分別鑒定的2100和1600種環狀RNA，且其中均有近600種是保守的（圖1C）。在樣本信息中篩選高水平表達的人類環狀物時（超過5次讀?。?，與小鼠環狀物的重疊性從25%增加到40%，可以讀出人類的基因組與小鼠存在同生性的區域重疊（圖1D）。
圖1 在分化的哺乳動物成肌細胞中鑒定circRNAs
2. 肌肉分化及疾病樣本中circRNA的表達差異
通過選擇肌肉分化和肌肉疾病的樣本，來定量分析circRNA的表達情況和調節機制。如圖2A-2B所示，散點圖顯示了肌母細胞（GM）和肌管（DM）在高表達circRNA中的讀取映射，結合熱圖中正常樣本（WT）和杜氏肌營養不良疾病樣本(DMD)的circRNA表達水平，發現了在不同細胞中circRNA表達水平不一。同樣，在相同基因組坐標下線性和環性讀取比率也遵循類似趨勢（圖2C-2D），可能與RNA分子穩定性有關。根據Cuffdiff計算FPKMs后的數據統計條形圖得知，相對于下調和非差異基因，上調基因明顯地誘導circRNA表達（圖2E-2F）。從circ-BNC2和circ-CDYL基因座的覆蓋圖來看，circ-CDYL可能是由于基因座的轉錄而被激活，且在肌細胞生成過程中環狀和線性的讀取同時增加。
圖2 在人類成肌細胞分化與疾病中circRNA差異性表達
3. 人類肌細胞的circRNA的基因敲除和表型篩選
首先基于RNAi進行circRNA功能篩選，針對29個circRNA來設計兩個小干擾RNA（siRNAs）。圖3A中的示意圖顯示表型篩選策略的實驗工作流程；圖3B中熱圖顯示兩個siRNAs 都抑制成肌細胞分化（每列表示一個表型，每行表示一個樣本）。對兩種常見的肌生成標記物（肌生成素、肌球蛋白重鏈）進行免疫熒光分析及DAPI染色，采用對照干擾siRNAs（si-SCR）、對抗circ-QKI的siRNAs (si-QKI #1) 和circ-BNC2 (si-BNC2 #1)分別誘導分化48h和96h，可觀察到表型變化與BNC2基因敲除相關。與此同時，結合qRT-PCR驗證，可推測在肌細胞分化開始時circ-BNC2可能與抗肌源性BNC2- mRNA產生競爭機制（圖3C-3D）。
圖3 人類肌細胞的circRNA的基因敲除和表型篩選
4. circ-ZNF609調控成肌細胞的增殖
在補充實驗中，通過溴脫氧尿苷標記分析成肌細胞中一組高表達circRNA與細胞增殖能力之間的關系。分別采用對照干擾siRNAs（si-SCR）和一系列對抗的siRNAs 治療人類成肌細胞，發現circ-ZNF609（siRNA #1）敲除組的BrdU熒光值顯著地下降了80%（圖4A）。圖4B顯示circ-ZNF609表型驗證的siRNAs技術流程，發現circ-ZNF609敲除后細胞增殖標志物（CDK1和細胞周期蛋白A2）均顯著性降低，與此同時在小鼠成肌細胞中也觀察到類似的現象（圖4C）。另外，通過比較三種不同siRNAs（si-circ，si-ex2，si-mRNA）活性來驗證初始篩選，熒光值顯示si-circ和si-ex2組成肌細胞的生長率降低了80%，而si-mRNa僅針對線性mRNA而不影響增殖（圖4C-4D）。采用qRT-PCR分析ZNF609 RNA（周期進展標志物CDK1和Cyclin A2）表達水平來確認三種siRNA的特異性（圖4E），進一步說明表型變化具有非靶向效應而增殖能力受circRNA活性影響。設計探針進行Northern Blot分析，發現circ-ZNF609對si-circ治療敏感和RNase R耐藥，但ZNF609 mRNA剛好與之相反（圖4F）。有趣的是，qRT-RCR檢測發現在控制成肌細胞的肌生成過程中，circ-ZNF609表達量在WT組中下調而在DMD組中上調，這些數據進一步加強了circ-ZNF609與成肌細胞增殖的聯系。
圖4 circ-ZNF609調控成肌細胞的增殖
5. circ-ZNF609編碼過程與多聚體有關
從圖5A來看，circ-ZNF609來源于宿主基因第二外顯子的環化，其內含一個753 nt的開放閱讀框（ORF），包含轉錄起始位點和終止密碼子（圖5A）。為了確定功能性，作者采用蔗糖梯度分餾測試circ-ZNF609在多聚體上的負載，并結合qRT-RCR分析得到沒有ORF 的circRNA（circ-PMS1）停留在游離RNA組分上，circ-ZNF609沉淀在多組分中，且后者的沉積模式是由主動翻譯引起的。另外在補充實驗中，核糖核酸酶R抗性結果證實了多聚體結合的circ-ZNF609 RNA發生環狀構象。
圖5 circ-ZNF609 RNA與多聚體有關
6. circ-znf609具有蛋白質編碼活性
如圖6A（P-Circ3XF結構的示意圖）所示，構建循環轉錄的表達載體測試circ-ZNF609的蛋白編碼能力。對編碼蛋白進行滴定檢測，結合WB檢測分析（圖6B）得到環狀模板產生的兩種亞型數量大致相同，但線性模板的翻譯強烈偏向于第一個ATG。為了進一步證明染色體基因circ-ZNF609 RNA 的蛋白質編碼能力，如圖6D所示，作者將33 FLAG編碼序列插入內源性ZNF609，再通過質譜檢測單個肽在蛋白質序列上的映射位置（圖6E），最后確定circ-ZNF609編碼蛋白質的過程。在正?；驘嵝菘藯l件下，用pcDNA或p-Circ3xf轉染Hela細胞并對蛋白質的抗標記抗體進行WB分析，發現了熱休克誘導的標記circ-ZNF609轉錄物被顯著地增強了翻譯過程（圖6G）。設計雙熒光素酶報告基因來測試circ-znf609是否具有IRES樣活性，結果顯示circ-znf609的UTR能夠以一種依賴于拼接的方式進行IRES工作。
圖6 circ-znf609具有蛋白質編碼活性
文章小結
本文作者采用體外分化的小鼠和人類成肌細胞進行circRNAs表達譜分析，并鑒定了在肌發生過程中受到調控和在杜氏肌營養不良中發生改變的保守物種。高含量功能基因組篩選出與成肌細胞增殖特異性相關的circ-ZNF609，同時發現其以一種剪接依賴和帽獨立的方式參與到真核生物的編碼蛋白過程。通過CRISPR/Cas9基因編輯獲得內源性標記等位基因的細胞系發現circRNAs的翻譯活性低，有趣的是，熱休克時標記circ-ZNF609翻譯的顯著激活，同時發現順式作用元件通過一個與帽無關的機制應對不同的細胞應力去啟動翻譯。綜上所述，文獻中作者發現的circ-znf609為這類無帽和多聚腺苷尾轉錄物翻譯所需的因子提供了相關材料，在未來仍然有必要進一步探究circRNA的功能機制。
解析文獻
Legnini I, Di Timoteo G, Rossi F, et al. Circ-ZNF609 is a circular RNA that can be translated and functions in myogenesis. Mol Cell. 2017 Apr 6; 66(1): 22-37.