提升CUT&Tag技能，就不怕卷單細胞ChIP技術了

要問DNA-蛋白質互作技術誰最火？就不得不提CUT&Tag技術了！CUT&Tag技術自2019年問世以來，不斷突破創新，從最初只能做組蛋白修飾，到現在越來越多轉錄因子見刊，甚至各種R-loop、G4結構的研究也被大量報道。更不要說單細胞技術爆火的現在，scCUT&Tag技術中，各種動物、細胞以及植物的文章見刊，并且CUT&Tag技術還衍生出了多靶標CUT&Tag，實現一個細胞，多個靶標的研究。

CUT&Tag技術發展歷程

2019年4月首次發表

2020年大量組蛋白修飾、少量轉錄因子研究見刊

2021年大量轉錄因子研究見刊

2021年1月 scCUT&tag在動物應用方向研究見刊

2021年12月 scCUT&tag在植物應用研究見刊

2022年3月 scCUT&tag +scRNA-seq單細胞多組學聯合應用見刊

2022年3月 CUT&Tag2for1技術推出

2022年12月 nano-CUT&Tag推出

更多應用持續更新……

最近經常聽到單細胞ChIP技術，小翌立馬查閱資料去一探究竟，結果發現還是換湯不換藥，這個單細胞ChIP技術不就是咱們scCUT&Tag么？

為了幫助大家提升CUT&Tag實驗技能，小翌整理了之前的一些CUT&Tag知識，同時將CUT&Tag實驗的甲醛交聯方案和CUT&Tag-qPCR方案一起匯總，希望大家進一步提升CUT&Tag技能，后續如果也想嘗試單細胞ChIP，或者是已經在做單細胞ChIP，咱們也能更得心應手。

CUT&Tag甲醛交聯方案

1.對于細胞樣本，將甲醛溶液加入細胞培養皿中，使甲醛終濃度為0.1%，室溫條件下，搖床上交聯2-5 min(若是目的蛋白表達水平過低可以適當延長交聯時間到10 min) ，交聯結束后，立即加入甘氨酸到培養皿中（終濃度0.1 M），搖床繼續搖15 min以終止交聯，然后進行后續的細胞捕獲（對于部分弱結合的轉錄因子，可將甲醛調為0.2%）;

2.對于組織樣本，將組織用剪刀剪成小塊后加預冷的PBS（含1%BSA），加入甲醛溶液使甲醛終濃度為0.1%，室溫搖床上搖2-5 min(若是目的蛋白表達水平過低可以適當延長交聯時間到10 min) ，交聯結束后，立即加入甘氨酸到培養皿中（終濃度0.1 M），搖床繼續搖15 min以終止交聯，之后，用組織勻漿器勻漿，將組織勻漿后的溶液過細胞篩以獲取細胞懸液，然后進行后續的細胞捕獲（對于部分弱結合的轉錄因子，可將甲醛調為0.2%）。

【注】

A：在CUT&Tag實驗開始前，我們需要確定實驗方案。隨著CUT&Tag技術的發展,科學家們發現有些目標蛋白質在研究時，輕微甲醛交聯效果更好。之后，更多的研究表明，使用CUT&Tag技術研究不同蛋白時，所需的實驗條件也不一樣。做組蛋白修飾、強結合的轉錄因子(如CTCF、RNA polll等)無需甲醛交聯。而一些弱結合的轉錄因子或轉錄輔因子則需要甲醛交聯，并且甲醛交聯的強度也不一樣。常規的輕微甲醛交聯條件為0.1%甲醛室溫交聯2 min，之后用0.1 M甘氨酸終止交聯。

B：若在實驗時，有添加甲醛進行輕微交聯，那么后續加終止buffer后，步驟稍微有調整哦！甲醛交聯后，蛋白酶K消化步驟調整為：向每個樣品中加入2 μL 15× Terminate Solution、1 μL DNA Spike-in mix和1 μL 30× Proteinase K（此時磁珠會板結）（若樣品較多，可一起提前配制）。全速渦旋樣品約10 sec，混勻后瞬離，將樣品置于PCR儀，55 oC消化2 h (熱蓋不低于70 oC)或者37 oC過夜。

CUT&Tag-qPCR方案

目前做CUT&Tag-qPCR時，有兩種，一種是蛋白酶K消化和gDNA提取后直接qPCR實驗，一種是完成建庫后進行qPCR。這兩種方式都有文獻可參考。目前翌圣更推薦完成建庫后進行qPCR實驗。

qPCR 定量檢測

qPCR試劑以翌圣的Hieff UNICON? Universal Blue qPCR SYBR Green Master Mix（Cat#11184）為例。

反應體系（推薦冰上配制）

【注】

使用前務必充分混勻，避免劇烈震蕩產生過多氣泡。

a) 引物濃度：通常引物終濃度為0.2 μM，也可以根據情況在0.1-1.0 μM之間進行調整。

b) 模板濃度：如模板類型為未稀釋cDNA原液，使用體積不應超過qPCR反應總體積的1/10。

c) 模板稀釋：cDNA原液建議5-10倍稀釋，最佳模板加入量以擴增得到的CT值在20-30個循環為好。

d) 反應體系：推薦使用20 μL或50 μL，以保證目的基因擴增的有效性和重復性。

e) 體系配制：請于超凈工作臺內配制，并使用無核酸酶殘留的槍頭、反應管；推薦使用帶濾芯的槍頭。避免交叉污染。

反應程序

【注】

快速程序適用于絕大多數基因，個別復雜二級結構基因可嘗試標準程序。

a) 退火溫度和時間：請根據引物和目的基因的長度進行調整。

b) 熒光信號采集（★）：請按照儀器使用說明書要求進行實驗程序設置，幾種常見儀器的時間設定如下：

20 sec：Applied Biosystems 7700, 7900HT, 7500 Fast

31 sec：Applied Biosystems 7300

32 sec：Applied Biosystems 7500

c) 熔解曲線：通常情況下可以使用儀器默認程序。

結果分析

定量實驗至少需要三個生物學重復。反應結束后需要確認擴增曲線及熔解曲線。

1) 擴增曲線：標準擴增曲線為S型。

Ct值落在20-30之間時，定量分析最準確；

Ct值小于10時，需要將稀釋模板后，重新進行實驗；

Ct值介于30-35之間時，需要提高模板濃度，或者增大反應體系的體積，以提高擴增效率，保證結果分析的準確性；

Ct值大于35時，檢測結果無法定量分析基因的表達量，但可用于定性分析。

2) 熔解曲線：

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