? ??細(xì)胞凋亡（apoptosis）一般是指機(jī)體細(xì)胞在發(fā)育過程中或在某些因素作用下，通過細(xì)胞內(nèi)基因及其產(chǎn)物的調(diào)控而發(fā)生的一種程序性細(xì)胞死亡(programmed cell death)。細(xì)胞凋亡對(duì)胚胎發(fā)育及形態(tài)發(fā)生（morphogenesis）、組織內(nèi)正常細(xì)胞群的穩(wěn)定、機(jī)體的防御和免疫反應(yīng)、疾病或中毒時(shí)引起的細(xì)胞損傷、老化、腫瘤的發(fā)生進(jìn)展起著重要作用，并具有潛在的治療意義。

????細(xì)胞凋亡途徑中各事件的發(fā)生是有時(shí)序性的，即各事件按先后順序依次發(fā)生，最終導(dǎo)致凋亡小體的出現(xiàn)，細(xì)胞隨著發(fā)生凋亡。典型特征為：細(xì)胞膜PS（磷脂酰絲氨酸）的外翻；線粒體膜電位的喪失；細(xì)胞核凝縮和斷裂。

一、PS（磷脂酰絲氨酸）在細(xì)胞外膜上的檢測(Annexin V法)：

????在正常的活細(xì)胞中，磷脂酰絲氨酸（phosphotidylserine，PS）位于細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)，但在早期凋亡的細(xì)胞中，PS?從細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到細(xì)胞膜的表面，暴露在細(xì)胞外環(huán)境中。Annexin-V（膜聯(lián)蛋白-V）是一種分子量為35-36KD的Ca2+?依賴性磷脂結(jié)合蛋白，能與PS高親和力結(jié)合。用熒光素（FITC、Alexa Fluor488等）標(biāo)記的?Annexin-V?作為探針，利用流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡可檢測細(xì)胞凋亡的發(fā)生。另外，碘化丙啶(propidine iodide, PI)是一種核酸染料，它不能透過完整的細(xì)胞膜，但在凋亡中晚期的細(xì)胞和死細(xì)胞，PI?能夠透過細(xì)胞膜而使細(xì)胞核紅染。因此將?Annexin-V?與?PI?匹配使用，就可以將凋亡早晚期的細(xì)胞以及死細(xì)胞區(qū)分開來。

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二、線粒體膜電位變化的檢測

在細(xì)胞凋亡的過程中往往伴隨著線粒體跨膜電位的破壞，這被廣泛認(rèn)為是細(xì)胞凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)過程中最早發(fā)生的事件之一。它發(fā)生在細(xì)胞核凋亡特征（染色質(zhì)濃縮、DNA斷裂）出現(xiàn)之前，一旦線粒體跨膜電位崩潰，則細(xì)胞凋亡不可逆轉(zhuǎn)。線粒體跨膜電位的存在，使一些親脂性陽離子熒光染料如?Rhodamine 123、JC-1、JC-10等可結(jié)合到線粒體基質(zhì)，其熒光的增強(qiáng)或減弱說明線粒體內(nèi)膜電負(fù)性的增高或降低。

JC-1是一種廣泛用于檢測線粒體膜電位△Ψm?的理想熒光探針，表現(xiàn)出電勢依賴性的積聚在線粒體內(nèi)。正常線粒體內(nèi)，JC-1聚集在線粒體基質(zhì)中形成聚合物，聚合物發(fā)出強(qiáng)烈的紅色熒光（Ex=585 nm, Em=590 nm）；而凋亡細(xì)胞，線粒體跨膜電位去極化，JC-1從線粒體內(nèi)釋放，濃度降低，逆轉(zhuǎn)為發(fā)射綠色熒光的單體形式。因此顏色的變化非常直接的反映出線粒體膜電位的變化。線粒體的去極化程度也可以通過紅/綠熒光強(qiáng)度的比例來衡量。JC-1的流式檢測是比較常見的一種方法。

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三、TUNEL（Terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick-end-labeling）

????細(xì)胞凋亡晚期，?染色體DNA雙鏈斷裂或單鏈斷裂而產(chǎn)生大量的粘性3-OH末端，可在脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶（TdT）的作用下，將熒光素/酶標(biāo)記的dUTP結(jié)合到DNA的3-末端，從而可進(jìn)行凋亡細(xì)胞的檢測，這類方法稱為脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法（terminal -deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling，?TUNEL）。由于正常的或正在增殖的細(xì)胞幾乎沒有DNA的斷裂，因而沒有3-OH形成，很少能夠被染色。TUNEL實(shí)際上是分子生物學(xué)與形態(tài)學(xué)相結(jié)合的研究方法，對(duì)完整的單個(gè)凋亡細(xì)胞核或凋亡小體進(jìn)行原位染色，能準(zhǔn)確地反應(yīng)細(xì)胞凋亡典型的生物化學(xué)和形態(tài)特征，可用于石蠟包埋組織切片、冰凍組織切片、培養(yǎng)的細(xì)胞和從組織中分離的細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)測定，并可檢測出極少量的凋亡細(xì)胞，因而在細(xì)胞凋亡的研究中被廣泛采用。

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