細胞凋亡系類產品

? ??細胞凋亡（apoptosis）一般是指機體細胞在發育過程中或在某些因素作用下，通過細胞內基因及其產物的調控而發生的一種程序性細胞死亡(programmed cell death)。細胞凋亡對胚胎發育及形態發生（morphogenesis）、組織內正常細胞群的穩定、機體的防御和免疫反應、疾病或中毒時引起的細胞損傷、老化、腫瘤的發生進展起著重要作用，并具有潛在的治療意義。

????細胞凋亡途徑中各事件的發生是有時序性的，即各事件按先后順序依次發生，最終導致凋亡小體的出現，細胞隨著發生凋亡。典型特征為：細胞膜PS（磷脂酰絲氨酸）的外翻；線粒體膜電位的喪失；細胞核凝縮和斷裂。

一、PS（磷脂酰絲氨酸）在細胞外膜上的檢測(Annexin V法)：

????在正常的活細胞中，磷脂酰絲氨酸（phosphotidylserine，PS）位于細胞膜的內側，但在早期凋亡的細胞中，PS?從細胞膜的內側翻轉到細胞膜的表面，暴露在細胞外環境中。Annexin-V（膜聯蛋白-V）是一種分子量為35-36KD的Ca2+?依賴性磷脂結合蛋白，能與PS高親和力結合。用熒光素（FITC、Alexa Fluor488等）標記的?Annexin-V?作為探針，利用流式細胞儀或熒光顯微鏡可檢測細胞凋亡的發生。另外，碘化丙啶(propidine iodide, PI)是一種核酸染料，它不能透過完整的細胞膜，但在凋亡中晚期的細胞和死細胞，PI?能夠透過細胞膜而使細胞核紅染。因此將?Annexin-V?與?PI?匹配使用，就可以將凋亡早晚期的細胞以及死細胞區分開來。

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二、線粒體膜電位變化的檢測

在細胞凋亡的過程中往往伴隨著線粒體跨膜電位的破壞，這被廣泛認為是細胞凋亡級聯反應過程中最早發生的事件之一。它發生在細胞核凋亡特征（染色質濃縮、DNA斷裂）出現之前，一旦線粒體跨膜電位崩潰，則細胞凋亡不可逆轉。線粒體跨膜電位的存在，使一些親脂性陽離子熒光染料如?Rhodamine 123、JC-1、JC-10等可結合到線粒體基質，其熒光的增強或減弱說明線粒體內膜電負性的增高或降低。

JC-1是一種廣泛用于檢測線粒體膜電位△Ψm?的理想熒光探針，表現出電勢依賴性的積聚在線粒體內。正常線粒體內，JC-1聚集在線粒體基質中形成聚合物，聚合物發出強烈的紅色熒光（Ex=585 nm, Em=590 nm）；而凋亡細胞，線粒體跨膜電位去極化，JC-1從線粒體內釋放，濃度降低，逆轉為發射綠色熒光的單體形式。因此顏色的變化非常直接的反映出線粒體膜電位的變化。線粒體的去極化程度也可以通過紅/綠熒光強度的比例來衡量。JC-1的流式檢測是比較常見的一種方法。

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三、TUNEL（Terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick-end-labeling）

????細胞凋亡晚期，?染色體DNA雙鏈斷裂或單鏈斷裂而產生大量的粘性3-OH末端，可在脫氧核糖核苷酸末端轉移酶（TdT）的作用下，將熒光素/酶標記的dUTP結合到DNA的3-末端，從而可進行凋亡細胞的檢測，這類方法稱為脫氧核糖核苷酸末端轉移酶介導的缺口末端標記法（terminal -deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling，?TUNEL）。由于正常的或正在增殖的細胞幾乎沒有DNA的斷裂，因而沒有3-OH形成，很少能夠被染色。TUNEL實際上是分子生物學與形態學相結合的研究方法，對完整的單個凋亡細胞核或凋亡小體進行原位染色，能準確地反應細胞凋亡典型的生物化學和形態特征，可用于石蠟包埋組織切片、冰凍組織切片、培養的細胞和從組織中分離的細胞的細胞形態測定，并可檢測出極少量的凋亡細胞，因而在細胞凋亡的研究中被廣泛采用。

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