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探秘細胞凋亡過程

——實用檢測方法盤點

>>>背景

圖1：細胞凋亡與壞死過程

細胞壞死（necrosis）是因病理而產生的被動死亡，如物理性或化學性的損害因子及缺氧與營養不良等均導致細胞壞死。表現為細胞脹大、胞膜破裂、細胞內容物外溢、核變化較慢、DNA降解不充分和引起嚴重的局部炎癥反應等。

細胞凋亡與細胞壞死不同，細胞凋亡（Apoptosis）一般是指機體細胞在發育過程中或在某些因素作用下通過細胞內基因及其產物的調控而發生的一種程序性細胞死亡過程，?細胞壞死是細胞受到強烈理化或生物因素作用引起細胞無序變化的死亡過程。細胞凋亡途徑中各事件的發生是有時序性的，即各事件按先后順序依次發生，最終導致凋亡小體的出現，細胞隨后發生凋亡。細胞凋亡對胚胎發育及形態發生（morphogenesis）、組織內正常細胞群的穩定、機體的防御和免疫反應、疾病或中毒時引起的細胞損傷、老化、腫瘤的發生進展起著重要作用，并具有潛在的治療意義。

表一：細胞凋亡與細胞死亡的區別

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表二：細胞凋亡的不同檢測方式

>>>探秘細胞凋亡，抓重點、找方法

細胞處于不同的凋亡階段需要找到不同的特點，配以合適的檢測工具就能準確解讀細胞凋亡的密碼。凋亡的細胞具有不同的生物學特征，典型的特征包括：1）細胞膜PS（磷脂酰絲氨酸）外翻；2）線粒體膜電位喪失；3）細胞核濃縮和斷裂

>>>凋亡早期檢測

在正常細胞中，磷脂酰絲氨酸（Phosphotidylserine, PS）位于細胞膜內側，但在早期凋亡的細胞中，PS由細胞膜的內側翻轉到細胞膜表面，暴露在細胞外環境中。Annexin-Ⅴ（膜聯蛋白-V）是一種分子量為35-36 kDa的Ca2+依賴性磷脂結合蛋白，能與PS高親和力結合，通過細胞外側暴露的磷脂酰絲氨酸與凋亡早期細胞的胞膜結合。將?Annexin-V?與?PI?匹配使用，就可以將凋亡早晚期的細胞以及死細胞區分開來。

圖2：Annexin-V?檢測早期凋亡原理示意圖

>>>線粒體膜電位變化的檢測

線粒體膜電位（△Ψm?）的丟失導致線粒體膜中線粒體通透性轉換孔的開放，細胞色素C（Cytochrome C）被釋放到細胞漿中，致使Caspase被激活從而誘導細胞凋亡。JC-1是一種廣泛用于檢測線粒體膜電位（△Ψm）的理想熒光探針，表現出電勢依賴性的積聚在線粒體內。正常線粒體內，JC-1聚集在線粒體基質中形成聚合物，聚合物發出強烈的紅色熒光；而在凋亡細胞中，線粒體跨膜電位去極化，JC-1從線粒體內釋放，濃度降低，逆轉為發射綠色熒光的單體形式。因此顏色的變化將直接反映出線粒體膜電位的變化。

圖3：JC-1檢測熒光與流式結果示意圖（圖片源自科學網）

>>>凋亡晚期檢測

細胞凋亡晚期，染色體DNA雙鏈斷裂或單鏈斷裂而產生大量的粘性3’-OH末端，可在脫氧核糖核苷酸末端轉移酶（TdT）的作用下，將熒光素/酶標記的dUTP結合到DNA的3’--OH末端，從而可進行凋亡細胞的檢測，這類方法稱為脫氧核糖核苷酸末端轉移酶介導的缺口末端標記法（terminal -deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling，TUNEL）

圖4：TUNEL法檢測原理示意圖

>>>客戶使用數據展示

Annexin-V檢測

(a-2, b-2) 100 μg/ml AuNCs@L-GSH?處理24h，(a-3, b-3) 100 μg/ml AuNCs@D-GSH?處理24h，(a-1, b-1)?無處理。

檢測試劑：Cat No.?40302?Annexin-V?-FITC/PI檢測流式分析早期凋亡

JC-1檢測

上象限中顯示去極化細胞的百分比；柱狀圖代表正常細胞，去極化細胞和壞死細胞的平均比例

檢測試劑：Cat No.?40705?JC-1檢測線粒體膜電位改變.

Tunel檢測

小鼠前脂肪細胞3T3-L凋亡檢測。第一行代表陰性對照，第二行代表陽性對照

檢測試劑：Cat No. 40306 TUNEL Apoptosis Detection Kit (FITC)

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石蠟包埋的腫瘤組織（取自裸鼠）

檢測試劑：Cat No. 40307 TUNEL Apoptosis Detection Kit (Alexa Fluor 488)

>>>已使用客戶發表文章引用

Annexin V

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