NGS文庫定量：快且準的Qubit or精確的qPCR，其實都不能少！
準確的文庫定量分析對獲得高質量測序數據十分關鍵。如果文庫定量濃度偏高，則可能由于成簇不足導致測序數據產量少；而定量濃度偏低則可能簇間信號干擾導致產生低質量的數據，甚至導致測序失敗；另外，隨著測序儀測序通量的提升，往往會將多個文庫合并到一起進行測序，需要按照測序數據量的要求，根據定量結果混合相應摩爾量的文庫，以穩定產出各樣本數據量，因此文庫的精準定量至關重要。
NGS中的定量主要有兩大系統，分別為基于實時熒光定量的qPCR和基于熒光光譜的Qubit定量方法。這兩種方法都可以進行相對準確的文庫濃度檢測，但在實際應用中仍然存在一些差異。
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Qubit定量 |
qPCR文庫定量 |
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特異性 |
熒光染料優先結合dsDNA |
僅測量同時含有P5端和P7端接頭的完整文庫片段 |
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DN**段長度 |
無特定限制 |
~300~450bp |
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準確度 |
高 |
非常高 |
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其實樣本量要求 |
1-20μl稀釋樣本 |
2μl~9μl稀釋樣本 |
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檢測濃度區間 |
0.2-100ng |
20 pM-0.0002 pM(視標準品濃度范圍而定） |
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標準品數量 |
一般為2個 |
一般為6個 |
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實驗手動操作時間 |
設置時間5min，單個樣本測量時間3s， |
~30min(96孔板） |
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檢測時間 |
5min-30min（視樣本量而定） |
~90min |
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適用儀器 |
Qubit（3.0/4.0）；有相應波長的酶標儀 |
熒光定量PCR儀 |
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適用場景 |
dsDNA定量；NGS文庫構建過程中的dsDNA定量，常規文庫快遞定量 |
上機文庫pooling前精準定量；珍貴樣本文庫定量；PCR-free文庫定量；FFPE文庫定量 |
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優勢 |
快速，準確；文庫構建過程中各反應階段樣本量監測的首選； 可定量樣本中的所有核酸類型； |
精準；可區分單雙鏈，文庫長度檢測準確，上機測序文庫結構完整，覆蓋度準確，測序數據DUP率低；多樣本檢測優選；
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Qubit定量
1. 定量原理
Qubit的原理是利用熒光染料結合在DNA分子上發出熒光，再對熒光強度進行測定從而得到核酸的濃度。熒光染料只有在與DNA雙鏈結合后才發出熒光，且所產生的熒光與DNA濃度呈正比。
2. 產品性能
即用型，5min實現準確定量
基于dsDNA HS Assay Kit for Qubit? 試劑盒研發的1×dsDNA HS Assay Kit for Qubit?，是一款即用型的Qubit預混液，將原有試劑盒中高濃度的濃縮染料預先稀釋成工作液，操作的時候僅需將工作液與待測樣本混勻即可通過Qubit? 熒光儀測定樣本濃度，使用更方便。
產品特點
簡便易操作：即用型預混液，無需配制工作液，操作簡單，定量更省時
超高的靈敏度：64x梯度稀釋精準定量，0.2 -100 ng dsDNA具有良好線性關系
超強的特異性：特異性檢測dsDNA，對一些常規污染物具有極好的耐受性
染料結合速度快：2 min 內即可達到飽和，快速讀取準確定量結果不用等
極高的穩定性：熒光信號持續3h，常溫防止20d不影響定量準確性
圖1. 產品穩定性測試結果室溫存放2周仍保持穩定（測定值與理論值偏差<10%）
注：測試方法，選取2個濃度的dsDNA，分別使用4℃存放的Thermo#Q33230、4℃存放的Yeasen#12642、室溫存放（約25℃）的Yeasen#12642在不同時間測定濃度值，每次測定值與第一次（記為0d）測定值計算偏差率。
圖2.產品穩定性測試，超強穩定性，有效期內測試結果相關性高
3. 更簡捷的操作流程
Qubit定量產品推薦
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翌圣類型 |
產品名稱 |
貨號 |
規格 |
用途及應用場景 |
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Qubit定量 |
12642ES60 |
100 T |
ü dsDNA定量 ü 文庫定量 |
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12642ES76 |
500 T |
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12640ES60 |
100 T |
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12640ES76 |
500 T |
qPCR定量
1. 定量原理
qPCR法利用熒光檢測技術與PCR技術相結合，在PCR反應體系中加入熒光基團，通過實時監測整個PCR過程中熒光信號的變化情況，反映濃度的變化，最后通過已知濃度的標準曲線計算未知樣品的濃度，以達到準確定量文庫濃度。
由于其特異性引物僅會定量兩端接頭連接完整的文庫，可排除單端或雙端都不連接接頭的不可測序文庫的干擾，因此qPCR法作為文庫定量的金標準，準確性最高。
2. 產品性能
本產品是用于 Illumina? 平臺高通量測序文庫濃度絕對定量的專用試劑盒，提供定量所需的DNA標準品、qPCR Master Mix、定量擴增引物和參比染料ROX。其中，DNA標準品包含經梯度稀釋的六份420bp的雙鏈DN**段溶液，濃度為20pM-0.0002pM；擴增引物對根據NGS文庫接頭序列P5和P7設計，可保證特異性擴增雙端接頭完整的文庫分子；qPCR MasterMix是基于抗體法熱啟動的染料法qPCR預混液，可在不同長度、不同GC或AT含量樣本中高效、特異擴增。
產品特點
精準定量：精準定量完整測序文庫，提高測序數據質量
適用性廣：穩定有效的定量不同長度、不同GC含量的文庫
便捷使用：試劑盒中包含ROX，方便qPCR儀器進行標準化
嚴格質控：批次間穩定性CV-5%
圖2. 文庫擴增曲線與標準曲線
圖3. 不同GC含量文庫模板所擴增熔解曲線特征峰單一
綠色38% GC文庫；紫色50% GC文庫；黃色70% GC文庫。
小結
兩種定量方法之間的檢測結果相當！
Qubit方法：優點是快速！單個樣本幾秒鐘內即可得到測序結果，直接輸出濃度，非常直觀；同時也可兼容大部分的酶標儀，進行批量樣本定量，是常規文庫定量、dsDNA定量的首選。缺點是檢測的精確度略低，檢測的是樣本中所有的dsDNA，也包含未連上測序接頭的DN**段，不能特異性的定量有效文庫（有完整測序接頭的文庫）；
qPCR方法：優點是精確度非常高，特異性精準定量有效文庫濃度，非常適用于測量珍貴樣本以及文庫上機pooling前的精準定量，另外在PCR-free的文庫構建中，由于沒有PCR富集有效文庫的過程，因此也推薦使用qPCR的方法來定量完整的文庫濃度，穩定測序產出。缺點是操作相對繁瑣，檢測時間較長。
總之兩種檢測方法各有千秋，NGS中根據需求選擇合適的定量方式，最好的是兩者結合，獲得更高質量更穩定的測序結果。
qPCR文庫定量產品推薦
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類型 |
產品名稱 |
貨號 |
規格 |
用途及應用場景 |
翌圣生物科技（上海）股份有限公司 商家主頁地 址： 上海市浦東新區天雄路166弄一號樓三層南單元 聯系人： 李自轉 電 話： 400-6111-883、021-34615995-8075 傳 真： 021-34615995-188 Email：lizizhuan@yeasen.com 相關咨詢國函批復！上海辰山國家植物園設立，國產試劑支撐植物多樣性科研攻關 (2026-07-03T00:00 瀏覽數:2599) 上新｜GMP級重組人GM-CSF，適配細胞治療、疫苗研發，全流程合規更省心 (2026-07-02T00:00 瀏覽數:3606) 上新｜GMP級重組人IL-18，免疫細胞增效核心原料 (2026-07-02T00:00 瀏覽數:3588) 100+ 種不同細胞全面驗證— 翌圣生物轉染試劑：高效低毒的國產優選 (2026-07-02T00:00 瀏覽數:3622) 科研人集合啦！曬出你的qPCR高光時刻 (2026-07-02T00:00 瀏覽數:3651) 重磅成果！翌圣生物聯合中檢院發表支原體檢測技術研究論文 (2026-06-30T00:00 瀏覽數:4805) 聚焦單細胞與空間組學前沿，翌圣生物亮相第二屆西部單細胞與空間組學論壇 (2026-06-30T00:00 瀏覽數:4978) 從機制到轉化：2026年5月高分文獻核心進展與趨勢解讀 (2026-06-26T00:00 瀏覽數:7768) Science 重磅成果：西湖大學團隊攻克共價蛋白藥物核心瓶頸，建立通用高通量速效蛋白篩選平臺 (2026-06-26T00:00 瀏覽數:7568) 類器官·血管生成·侵襲·成瘤 | 基質膠應用案例合集 (2026-06-26T00:00 瀏覽數:7694) ADVERTISEMENT
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