編者按

 高血壓是最普遍的慢性疾病，也是主要的健康挑戰。多種類型的先天和適應性免疫細胞及其分泌的細胞因子已被證明參與高血壓的發病機制。然而，對免疫細胞的激活如何導致高血壓的發生和發展的機制研究仍然缺乏。

今天，我們分享2022年12月由德國柏林自由大學研究團隊發表在《Cardiovascular Research》的一項研究成果，該研究建立了離子失衡驅動RAS失調的斑馬魚及小鼠模型，揭示了炎癥信號導致高血壓腦損傷發展的機制，通過免疫通路對大腦結構和功能重構的細胞和分子作用，確定抗干擾素-γ治療是一種有潛力的干預策略，能夠驅動巨噬細胞重編程、腦血管重構及認知功能障礙等，防止壓力超載引起的腦血管和神經系統損傷。

實驗結果表明，不同類型的免疫細胞與脈管系統、心臟和大腦相互作用，失調的免疫細胞通過破壞這些器官的血壓調節功能來驅動高血壓的發展。更好地了解不同免疫細胞亞群的位點特異性作用，以及了解將高血壓信號傳遞給受影響器官的免疫途徑的機制，是開發治療臨床高血壓的免疫靶向策略的基礎。

文章題目

Interferon-γ drives macrophage reprogramming,cerebrovascular remodelling, and cognitive dysfunction in azebrafish and a mouse model of ionimbalance and pressure overload

雜志：Cardiovascular Research（IF=10.2）

發表時間：2022年12月20日

作者：Dilem C. Apaydin, Bhakti I. Zakarauskas-Seth, Alessandro Filosa, and Suphansa Sawamiphak等

單位：德國柏林自由大學等

01、研究背景

高血壓是最普遍的慢性疾病，也是主要的健康挑戰。雖然血壓升高是高血壓的主要診斷特征，但其死亡率和致殘是相關心血管合并癥的結果，如心力衰竭、中風、慢性腎臟疾病和認知障礙。目前的治療策略主要針對控制生理性血壓、交感神經系統和腎素(Ren)血管緊張素(Agt)系統的關鍵調控通路。雖然這些藥物有助于在一定比例的原發性高血壓患者中達到目標血壓水平，但仍難以阻礙目標器官損傷的進展。對于腦血管的改變尤其如此。越來越清楚的是，即使在血壓水平可接受的受試者中，心血管事件的殘余風險升高也可能持續存在，強調存在其他疾病驅動因素。

在高血壓和終末器官損傷的發病機制中，全身性炎癥和免疫反應性的關鍵作用已得到充分認識。多種類型的先天和適應性免疫細胞及其分泌的細胞因子已被證明參與高血壓的發病機制。然而，文中對這些免疫細胞的激活如何導致高血壓的發生和發展的機制理解仍然缺乏。人們普遍認為，先天免疫細胞作為高血壓刺激下炎癥反應的啟動者，在血管損傷中起著關鍵作用。單核細胞/巨噬細胞缺乏減輕血管緊張素II (Ang II)、醛固酮、和內皮素-1誘導血管功能障礙和氧化應激在抵抗動脈和主動脈中的作用。同樣，在小鼠高血壓模型中，腦血管周圍巨噬細胞的消融可阻止大腦中動脈的結構和功能重塑以及腦血管氧化應激。免疫細胞在高血壓中的有害作用并不僅僅依賴于促炎細胞因子或活性氧的產生。研究表明，在醛固酮和鹽誘導的高血壓時積聚在心臟的巨噬細胞亞群產生的白細胞介素(IL)10可促進心臟纖維化和舒張功能障礙。

總的來說，大量證據表明不同類型的免疫細胞與脈管系統、心臟和大腦相互作用，這表明了一個總體假設，即失調的免疫細胞通過破壞這些器官的血壓調節功能來驅動高血壓的發展，對更好地了解不同免疫細胞亞群的位點特異性作用，以及了解將高血壓信號傳遞給受影響器官的免疫途徑的機制有重要作用，這也是開發治療臨床高血壓的免疫靶向策略的基礎。

在這里，我們解決了三個主要問題：由免疫細胞驅動的血壓調節器官的不良重塑背后的細胞過程；細胞事件的分子介質；以及操縱已識別的免疫通路是否可以預防高血壓和終末器官的病理重塑。通過引入離子差誘導的體液穩態紊亂，我們建立了一種新的斑馬魚模型來模擬人類高血壓的多系統結構和功能重塑特征，與現有的嚙齒類動物模型相比，其優勢在于需要更簡單的操作和更短的治療時間。

重要的是，該模型不僅允許對高血壓的多系統表型進行死后表征，還可以實時成像追蹤致病過程中的細胞行為。利用斑馬魚模型，能夠展示暴露于離子失衡刺激到大腦發生病理的過程，即巨噬細胞/小膠質細胞-內皮細胞接觸和內皮連接中斷期間，內皮細胞遷移驅動腦血管退行性改變和腦細胞死亡增加。

從機制層面來看，研究人員發現干擾素-γ（IFNγ）信號通路是系統性炎癥驅動的動脈功能障礙和離子失衡驅動的腦重塑的關鍵介質。在低離子暴露背景下，IFNγ信號下調巨噬細胞/小膠質細胞中的穩態、促血管生成和神經保護因子。我們發現其中一個因子，骨形態發生蛋白（BMP）5參與了IFNγ驅動的致病途徑。最后，在心臟壓力超負荷誘導的小鼠腦病理模型中，我們提供了炎癥靶向治療的證據，可以消除腦血管稀疏、血-腦屏障（BBB）和內皮連接中斷以及認知功能障礙等。

圖形摘要

02、研究結果

1.  建立離子穩態失衡模型來模擬斑馬魚幼體動脈高血壓

2-4 dpf，胚胎在去離子水稀釋至1:750濃度的Danieau緩沖液中飼養，隨后將濃度降至1:1500，繼續處理至7 dpf(圖1A)。測量了背主動脈的血流速度，觀察到舒張末期明顯降低(圖1B和C)，在較小程度上，在背主動脈測量到峰值收縮速度(圖1B和D)，表明動脈壓力和/或阻力增加。動脈阻力指數是高血壓患者動脈硬度相關的血管阻力和順應性改變的指示性參數，在治療不良的幼魚中也升高(圖1E)。

圖1 低離子會導致斑馬魚動脈高血壓

2. RAS失調介導離子失衡引起的動脈功能障礙

通過定量逆轉錄聚合酶鏈反應(qRT-PCR)評估了在致病性級聯啟動期間暴露于離子缺乏處理的幼魚中這兩個基因的時間過程表達(2-5 dpf)。低離子處理2天后，可檢測到agt水平顯著升高，而ren表達水平在此階段沒有變化(圖1F)。agt表達在治療3天后進一步增加，同時也可檢測到ren升高(圖1F)。

此外，還研究了RAS拮抗劑對動脈血流變化的影響。氯沙坦在2-5 dpf的低離子暴露早期(圖1G)確實減弱了刺激對舒張期測量的動脈流速降低和動脈阻力指數升高的影響(圖1H-K)。文中還研究了氯沙坦在低離子暴露期間4-7 dpf的晚期給藥的影響(圖1G)。有趣的是，這種晚期干預無法緩解離子不良治療引起的動脈壓力/抵抗表型(圖1H-K)。

3. 離子失衡導致心肌細胞肥大和心室舒張功能不全

接下來，文章研究了離子差誘導的高動脈壓是否足以驅動最常與高血壓相關的心血管并發癥。經過5天的低離子處理后，幼魚表現出心室舒張能力下降，表現為舒張期心室壁運動較慢(圖2A和B)。但這些心臟的收縮速度沒有改變(圖2C)。

心肌細胞大小分析顯示，離子缺乏處理的心室細胞體積增加(圖2F和G)，表明肥厚生長。缺乏離子處理的心室與對照組含有相似數量的心肌細胞(圖2H和I)。心室容積也未受影響(圖2J和K)，提示同心性肥厚的建立。在離子不良誘導的RAS激活的早期或晚期阻斷RAS(圖1G和F)并不能預防心肌舒張功能障礙(圖2L)。

這些結果表明，離子化治療，獨立于RAS，導致心室舒張功能障礙與心肌細胞適應性肥厚重塑相關，而心肌細胞無死亡，類似于保留射血分數(HFpEF)的早期心力衰竭的某些功能和形態學特征。

圖2 斑馬魚模型中，離子失衡使RAS非依賴性心室舒張功能失調重構

4. 離子失衡導致腦血管退化，血管相關巨噬細胞/小膠質細胞增加，腦內細胞死亡

在驗證了心血管表型的存在和高血壓關鍵分子標記物的升高對低離子環境治療的反應后，文章接下來研究了斑馬魚模型中靶器官不良重構和免疫細胞參與的細胞過程。在低離子環境處理3天后，缺離子組的血管密度明顯降低(圖3A和B)，通過末端脫氧核苷酸轉移酶2'-脫氧尿苷，5'三磷酸(dUTP)缺口末端標記(TUNEL)檢測，血管稀薄發生在整個腦深部(圖3B)，并與實質細胞死亡增加相關(圖3A和C)。內皮細胞死亡未顯著增加(圖3D)，提示細胞凋亡可能不是離子失衡驅動的腦血管稀疏的主要機制。隨后，在治療5天后，也可以檢測到腦容量的減少(圖3E)。

在對照條件下飼養的斑馬魚幼魚主要顯示出穩定的腦血管網絡(圖3F)。文中捕捉到了來自同一血管節段的內皮細胞相互收縮和遷移，導致血管節段后退的動態過程(圖3F)。此外，在低離子環境處理組中，位于血管附近且僅沿著血管碎片移動的csfiro+細胞數量較多(圖3G和H)。相比之下，實質的csfiro+細胞數量保持不變(圖3G和 I)，表明巨噬細胞/小膠質細胞與血管之間的相互作用增強，但并非腦實質中所有髓系細胞都擴增。

綜上所述，離子不良誘導的RAS上調所啟動的致病途徑不僅會引發心血管系統的重構，還會通過免疫細胞和非免疫細胞的一系列細胞反應，如巨噬細胞/小膠質細胞與腦血管的關聯增加、內皮遷移介導的血管消退、腦實質細胞死亡等，引發大腦的重構。有趣的是，離子不良誘導的內皮退化主要影響微血管(直徑5um)，而不影響更大的血管(圖3)。因此，離子失衡引發的全系統反應再現了血管、心臟、大腦和腎臟的損傷，這些都是人類高血壓的主要靶器官。

5. 離子失衡誘導的腦血管縮回中，內皮-巨噬細胞/小膠質細胞的相互作用和內皮連接破壞

接下來進一步了解了在離子處理不良的動物中觀察到的腦血管退化的細胞機制。雖然對巨噬細胞/小膠質細胞內皮相互作用與血管退化之間關系的分析顯示，與兄弟姐妹相比，離子處理不良的小鼠出現更頻繁的退化(圖3K)，但在對照條件下，巨噬細胞/小膠質細胞接觸與較少的退化事件相關(圖3L)，這意味著先天免疫細胞的保護作用。

相比之下，在離子不平衡的情況下，與巨噬細胞/小膠質細胞事先接觸或未接觸的血管段的類似退化事件表明保護作用喪失(圖3L)。還發現在離子不良處理下，沿腦血管網絡的連接覆蓋減少(圖3M和N)。除了捕捉回縮前內皮-巨噬細胞/小膠質細胞的相互作用和血管段重建(圖3O)，文中的分析顯示，低離子環境處理改變了巨噬細胞/小膠質細胞沿血管網絡的分布。

在對照條件下，大多數血管相關巨噬細胞/小膠質細胞與灌注/膨脹的血管接觸。只有少數巨噬細胞/小膠質細胞與退化事件有關，這是血管床生理成熟的一部分(圖3P)。長期不良治療對灌注血管的巨噬細胞/小膠質細胞覆蓋范圍沒有重大影響，但增強了它們與塌陷血管的相互作用(圖3P)。

此外，在離子處理不良的大腦中，巨噬細胞/小膠質細胞接觸后，內皮間連接退化是明顯的(圖3Q)。通過對巨噬細胞/小膠質細胞和內皮細胞行為的延時追蹤，不僅揭示了離子失衡在這些細胞之間的動態相互作用中的作用，而且還揭示了巨噬細胞/小膠質細胞血管保護功能的改變可能導致微血管收縮的細胞機制。

圖3 離子失衡驅動的腦血管退行性改變及腦細胞死亡，與巨噬細胞/小膠質細胞-內皮細胞接觸增加、內皮間連接重構相關

6. 離子失衡通過ifnγ信號傳導上調促炎細胞因子ifnγ和il - 1β，扭曲巨噬細胞組織穩態/神經保護表型

在低離子環境處理的第1天，與對照組相比，qRT-PCR顯示候選細胞因子的表達沒有改變(圖4A)。治療2天后，兩種細胞因子(ifng和il1b)的表達水平略有增加(約1.5倍)，但沒有統計學意義(圖4B)。治療3天后的后續評估顯示，ifng和il1b mRNA分別上調2倍和8倍以上(圖4C)。這兩種促炎細胞因子的升高表明，可能由RAS失調引起的全身性炎癥參與了離子缺乏誘導的致病途徑。

在接受3天的低離子暴露，并在治療一天后心包內注射對照V5或抗ifnγ抗體以阻斷干擾素γ受體(Ifngr) 1的激活(圖4D)。對比轉錄組學分析顯示，在離子失衡的情況下，巨噬細胞不僅會破壞先天免疫功能，還會減弱炎癥解決和組織穩態維持的幾種關鍵介質的表達(圖4E和F)。

具體而言，離子缺乏處理的巨噬細胞下調補體系統調節劑補體因子H相關5 (cfhl5)，以及殺菌和先天免疫效應肽自然殺傷(NK)-溶解素(nkl)。參與抗炎反應和炎癥消退的不同酶，如A分解素和金屬蛋白酶結構域10b (adam10b)、組氨酸解氨酶(hal)和賴氨酸去甲基酶5A (kdm5a) (圖4E和F)的表達也減少(圖4E和F)。文中觀察到暴露于離子失衡后，分泌因子和細胞表面受體轉錄抑制，包括bmp5、核結合蛋白2a (nucb20)、和叢蛋白D1 (plxnd1)(圖4E和F)，據報道在不同病理環境下的神經元和血管穩態和損傷預防中起重要作用。

重要的是，抗ifnγ介導的內在細胞因子信號的抑制阻止了離子缺乏驅動的轉錄程序的激活(圖4E和G)，表明ifnγ信號是離子失衡反應中巨噬細胞表型改變的關鍵介質。從文中的轉錄組學分析中，文中還注意到，與它的同源受體ifngr1不同，ifnγ在巨噬細胞中沒有表達。

圖4  高血壓刺激下，以巨噬細胞中ifng和il1b上調、Ifnγ信號依賴性的神經保護和穩態基因表達下調為特征的系統性炎癥

7. ifnγ信號是離子失衡驅動的腦血管退化的基礎

接下來，文中采用遺傳功能喪失模型研究了ifnγ信號在離子失衡驅動的腦血管重構中的可能因果作用：在沒有離子不平衡刺激的情況下，ifngr1-/-幼魚的腦血管形態和密度與對照組(ifngr1+/+)相當(圖5A和B)。相比之下，暴露于低離子培養基導致治療3天后腦血管密度降低(圖5A和B)。缺乏ifngr1保護腦血管免受低離子介導的退化(圖5A和B)。這表明ifnγ信號在腦血管系統對離子失衡的致病反應中起著關鍵作用。

因此，繼續探討了細胞因子是否可能代表一種治療靶點，能夠在表型表現進展后預防和/或減輕終末器官損傷。為此，在動脈高血壓和腦血管稀疏(處理3天)檢測到后，文中在連續5天的低離子暴露期間，用單劑量心包內注射抗lfnγ抗體?？筶fnγ治療模式能夠減輕腦血管稀薄(圖5C和D)。且晚期抗lfnγ抗體治療也減輕了收縮期和舒張期離子不良引起的動脈血流速度降低(圖5E-G)。然而，通過舒張期心室壁速度測量，該治療并沒有恢復舒張功能障礙(圖5H)。

總的來說，這些發現揭示了炎癥驅動的高血壓發病機制，其中ifnγ的異常產生驅動大腦重塑，其特征是腦血管退化和腦細胞死亡增加。干擾ifnγ通路的激活可以減輕血管損傷和動脈高血壓，但不足以阻止心臟重構的進展。

8. 補充BMP5可預防離子不平衡引起的腦血管稀疏

巨噬細胞/小膠質細胞轉錄組改變和功能失調，從它們在離子失衡挑戰下的接觸相關內皮退化中得到證實，表明ifnγ介導的巨噬細胞旁分泌信號的損傷可能是介導腦血管重構的潛在機制。

值得注意的是，文中發現ifnγ介導的巨噬細胞/小膠質細胞轉錄下調的下游靶標BMP5是離子失衡驅動的腦血管稀散的重要調節劑。從低離子暴露的第二天開始，用重組人BMP5對斑馬魚幼魚進行2天處理，可以阻止腦血管稀疏的進展，這可以從保留腦實質的總體血管覆蓋范圍(圖5J)和血管網絡中微血管的百分比(圖5K)中看出。

因此，文中的研究結果為離子失衡引發的炎癥通路驅動腦損傷提供了進一步的機制見解，其中ifnγ的升高表明巨噬細胞/小膠質細胞中bmp5的下調，導致這些細胞的血管穩態功能受損，從而破壞內皮細胞間連接和收縮。

圖5 Ifnγ及下游信號靶點Bmp5調節血管對離子失衡的高血壓刺激的反應

9. 抗ifnγ治療可防止壓力過載小鼠皮質毛細血管稀疏和血腦屏障破壞

對大腦皮層切片進行的離體免疫組化(圖6A)顯示出神經血管單元損傷的清晰模式。腦毛細血管結構分析顯示，與假性正常對照組相比，TAC-IgG高血壓小鼠的毛細血管明顯稀疏，由CD31標記的血管密度降低(圖6B和C)證明(圖6D)，同時保持正常直徑(圖6D)。TAC-IgG小鼠顯示周細胞的毛細血管覆蓋率顯著降低(圖6E和F)，這是神經血管單位完整性的典型標志。有趣的是，抗ifnγ治療挽救了TAC小鼠觀察到的腦血管缺陷，顯示出正常的毛細血管密度(圖6B和C)和周細胞覆蓋(圖6E和F)。

為了研究高血壓對腦微循環功能特性的影響，給TAC高血壓小鼠和正常對照組灌注不同分子量右旋糖酐，然后剔除動物進行腦組織學分析。通過使用高分子量葡聚糖(2000000 Da)(圖6G)，對灌注毛細血管的密度進行分析，進一步證實與假對照組相比，TAC誘導的毛細血管密度顯著降低(圖6H)。經抗ifnγ抗體處理的TAC小鼠未出現毛細血管稀疏(圖6H)。

此外，聯合使用低分子量葡聚糖(40000 Da)(圖6G)，使我們能夠評估通過血腦屏障的外滲情況。通常，40 kDa葡聚糖被完整的血腦屏障保留，但它會滲透到受損和滲漏的血腦屏障中。如圖6G-I所示，TAC-IgG小鼠顯示少量紅色標記的毛細血管，表明它們無法保留低分子量葡聚糖，從而表明血腦屏障完整性降低。

圖6 IFNγ抑制壓力過載腦損傷小鼠模型中腦血管系統的不良重塑

重要的是，使用中和性抗ifnγ抗體處理的TAC小鼠顯示出完整的血腦屏障，與假正常血壓小鼠相當。高血壓患者血腦屏障功能障礙被歸因于AngⅡ誘導的緊密連接重構和細胞吞噬增加。內皮連接復合物的關鍵成分，vacular endothelial (VE)-cadherin和Claudin5，實際上在TAC小鼠的大腦皮層中都下調(圖7A-C)，表明血管連接重構。ifnγ中和有效地挽救了這些蛋白的表達(圖7A-C)。

此外，抗ifnγ治療減少了tac誘導的晚期糖基化終產物(RAGE)受體的上調，RAGE是一種主要的外排轉運體，介導循環淀粉樣蛋白-β(Aβ)在BBB中的胞飲作用(圖7D和E)，這意味著除了連接穩定外，它還具有抑制肽經血管轉運進入大腦的潛力，這是高血壓認知障礙和癡呆的主要原因。

10. 抗ifnγ治療可預防壓力過載小鼠的認知損傷

TAC后4周，采用Morris水迷宮測試評估小鼠的認知功能，所有實驗組都能在視覺提示的指示下找到并到達平臺(圖7F)，這表明所有小鼠都具有相當的視覺和運動能力。

在測試的獲取階段，雖然使用非相關IgG治療的TAC小鼠表現出高時間延遲到達平臺，但從第一天到第三天的表現沒有任何改善(圖7G)，抗ifnγ治療顯著改善了TAC小鼠的表現，其表現出與Sham小鼠相當的學習曲線(圖7G)。在探針試驗期間，tac -抗ifnγ高血壓小鼠表現出保留的記憶，如回憶平臺位置的能力所示。在隨機游過象限的TAC-lgG小鼠中，同樣的認知功能明顯受損(圖7H和圖I)。因此，除了腦血管保護外，阻斷ifnγ信號傳導還能夠防止壓力過載引發的認知功能下降。

圖7 通過抗IFNγ治療預防壓力過載引發的內皮連接完整性的破壞和認知功能下降

03、編者點評

綜上所述，本研究利用一種新的離子失衡驅動的斑馬魚RAS失調模型，通過一系列的基因表達分析和實時成像，了解炎癥性疾病進展的時間進程，并識別參與先天免疫細胞激活的細胞事件，揭示了炎癥信號導致高血壓腦損傷發展的機制，并確定抗干擾素治療是一種有前途的干預策略，能夠防止壓力過載引起的腦血管和神經系統損傷。

研究人員發現，離子失衡引發RAS升高和全身炎癥，以Ifnγ和Il1β上調為標志，導致巨噬細胞/小膠質細胞和內皮細胞的行為和功能顯著改變。研究人員觀察到巨噬細胞/小膠質細胞-內皮接觸相關的內皮連接重塑和收縮，以及細胞向血管節段的相反兩側的橫向遷移，導致血管網絡的退化，而對血管細胞的死亡沒有影響。失調的免疫反應導致控制高血壓和降低終末器官損傷風險的治療策略效率低下，揭示出從高血壓刺激開始到多器官功能障礙表現的免疫途徑，是免疫靶向治療急需的見解。

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