非編碼RNA在許多腫瘤發(fā)生發(fā)展的各階段的起到重要作用，是目前腫瘤研究的熱點(diǎn)。非編碼RNA幾乎參與了腫瘤細(xì)胞的增殖、分化、轉(zhuǎn)移。此外，非編碼RNA作為疾病標(biāo)志物不斷被發(fā)現(xiàn)，正成為研究人員尋找相關(guān)腫瘤治療的靶標(biāo)。
長鏈非編碼RNA（lncRNA）是一類非編碼RNA，其長度在200nt以上，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中具有多種作用，它以ceRNA方式作為海綿吸附miRNA從而調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)，也可以協(xié)同轉(zhuǎn)錄因子激活相關(guān)基因的表達(dá)或者結(jié)合蛋白防止蛋白降解從而促進(jìn)蛋白相關(guān)功能的發(fā)揮。lncRNA的ceRNA網(wǎng)絡(luò)研究目前已經(jīng)較為普遍，這里我們將借助一篇文獻(xiàn)，主要從lncRNA與多種蛋白及核酸互作的角度來介紹lncRNA的功能、機(jī)制研究。
1. 通過模型和臨床標(biāo)本尋找要研究的lncRNA—H19
基于前期miRNA與腹部動(dòng)脈瘤的相關(guān)研究結(jié)果，作者欲從長鏈非編碼入手探究其與腹部動(dòng)脈發(fā)生發(fā)展關(guān)系。作者首先建立了鼠腹動(dòng)脈瘤模型和迷你豬動(dòng)脈瘤模型，運(yùn)用lncRNA測序研究了腹部動(dòng)脈瘤鼠模型、人體組織標(biāo)本中穩(wěn)定未破的和破裂的瘤體組織lncRNA的表達(dá)譜綜合交錯(cuò)分析，發(fā)現(xiàn)H19是在兩種模型和人體組織中上調(diào)差異最明顯的lncRNA。
圖1 AngⅡ誘導(dǎo)后七天檢測的受異常調(diào)控的轉(zhuǎn)錄本的火山圖
2. 原位雜交、細(xì)胞增殖、凋亡及基因敲減驗(yàn)證H19的定位及功能特性
原位雜交顯示，H19主要在無病組織的中層平滑肌細(xì)胞（SMC）和外膜成纖維細(xì)胞中表達(dá)，血管緊張素II（AngII）刺激后H19在中層血管平滑肌細(xì)胞中表達(dá)增加，說明H19通過影響血管平滑肌細(xì)胞的動(dòng)力學(xué)參與腹動(dòng)脈瘤發(fā)生發(fā)展。
細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)顯示AngII可以促進(jìn)SMC細(xì)胞的凋亡，降低細(xì)胞的增殖速率，同時(shí)，AngII可以提高H19的表達(dá)，H19的敲減可以抑制AngII的功能作用。對(duì)H19做進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)H19可以促進(jìn)SMC細(xì)胞的凋亡，而敲減H19可以抑制細(xì)胞的凋亡，但是H19的表達(dá)變化對(duì)細(xì)胞的增殖沒有影響。
圖2 H19敲低和過表達(dá)對(duì)腹動(dòng)脈瘤和血管平滑肌細(xì)胞生長、增殖和凋亡的影響
3. H19不是通過miR-675的剪切表達(dá)調(diào)控SMC細(xì)胞的功能
miR-675在H19的第一個(gè)外顯子上，前期研究表明H19可以剪切表達(dá)miR-675，通過miR-675發(fā)揮調(diào)控作用。這里作者對(duì)H19是否通過miR-675發(fā)揮作用進(jìn)行了研究，通過構(gòu)建缺失miR-675表達(dá)載體，與野生型共轉(zhuǎn)染到SMC細(xì)胞中，野生型和缺失突變型均誘導(dǎo)了細(xì)胞的凋亡。同時(shí)，在組織樣本和AngII誘導(dǎo)的腹動(dòng)脈瘤模型中均未檢測到miR-675的顯著差異表達(dá)。說明H19不是通過miR-675來調(diào)控SMC的凋亡的。
圖3 miR-675缺失突變型和野生型的H19均誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡抑制細(xì)胞增殖
4. H19調(diào)控SMC表達(dá)的途徑
作者接著從轉(zhuǎn)錄因子入手，通過生信分析，篩選出了幾個(gè)可以和H19互作的轉(zhuǎn)錄因子，分別為CREB1（cAMP responsive element binding protein 1）、TFCP2（transcription factor CP2）、GTF2IRD1（GTF2I repeat domain containing 1）、SMAD4（SMAD family member 4）、HIF1α、ZBTB14（zinc finger and BTB domain containing 14）、KLF11（Krüppel-like factor 11）、TFAP2α（transcription factor AP-2 alpha）。作者接著在SMC中過表達(dá)、敲低H19，用定制的RNA表達(dá)芯片檢測上述轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)過表達(dá)H19可以促進(jìn)HIF1α的表達(dá)，抑制H19可以抑制HIF1α的表達(dá)，HIF1α是唯一受調(diào)控的轉(zhuǎn)錄因子。
圖4 q-PCR檢測過表達(dá)和敲低H19后相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)
如何證明是HIF1α調(diào)節(jié)H19在SMC中的發(fā)揮功能作用的呢？SMC細(xì)胞中干擾HIF1α后，HIF1α的mRNA和蛋白表達(dá)量均顯著下調(diào)，同時(shí)，促凋亡蛋白BAX也與HIF1α的表達(dá)一致，BCL-2的表達(dá)量則相反，但是H19的表達(dá)量沒有改變。相反，H19的過表達(dá)可以顯著提高HIF1α的表達(dá)。這些結(jié)果暗示了H19可能通過HIF1α來調(diào)控細(xì)胞的凋亡。
圖5 q-PCR檢測過表達(dá)和敲低HIF1α后凋亡相關(guān)分子的表達(dá)
由于BAX是受P53調(diào)控，因此P53可能參與H19促凋亡。通過敲低P53的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)P53的敲低可以顯著抑制HIF1α過表達(dá)或者AngII促進(jìn)的SMC細(xì)胞凋亡，這說明P53參與了H19-HIF1α誘導(dǎo)的凋亡。有報(bào)道，肺癌和鼠胚胎成纖維細(xì)胞中P53是受E3泛素連接酶Mdm2（mouse 3T3 cell double minute 2）的調(diào)控。作者接著通過Co-IP及相關(guān)刺激因子誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)，證實(shí)了HIF1α可以和Mdm2結(jié)合從而降低P53的泛素化，促進(jìn)SMC細(xì)胞的凋亡。
圖6 CO-IP實(shí)驗(yàn)證實(shí)HIF1α可以與Mdm2結(jié)合
H19、HIF1α、BAX、BCL2在人類疾病樣本和兩種鼠模型中的表達(dá)模式與上述細(xì)胞系研究中的結(jié)果相符，進(jìn)一步地驗(yàn)證了上述的結(jié)論。
圖7 H19、HIF1α、BAX、BCL2在疾病樣本和鼠模型中的表達(dá)
5. H19與HIF1α在胞質(zhì)中的共定位及互作
H19有無可能直接與HIF1α互作呢？生物信息學(xué)分析顯示H19上有結(jié)合HIF1α的二級(jí)結(jié)構(gòu)，作者接著采用了原位雜交、鄰位連接(PLA)技術(shù)證實(shí)了H19與HIF1α在胞質(zhì)中的共定位及互作（<40nm）。
圖8 原位雜交、鄰位連接(PLA)技術(shù)證實(shí)H19與HIF1α在胞質(zhì)中的共定位及互作
6. 細(xì)胞核中的H19通過與SP1及HIF1α啟動(dòng)子結(jié)合促進(jìn)HIF1α的轉(zhuǎn)錄
前面研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)H19可以促進(jìn)HIF1α的表達(dá)，那么能在細(xì)胞質(zhì)中與HIF1α結(jié)合的H19能直接在細(xì)胞核中發(fā)揮調(diào)控HIF1α的作用嗎？
已有研究發(fā)現(xiàn)HIF1α的轉(zhuǎn)錄依賴于轉(zhuǎn)錄因子特異蛋白1（Sp1），HIF1α啟動(dòng)子區(qū)域有幾個(gè)與Sp1結(jié)合的位點(diǎn)，H19有可能通過影響Sp1的結(jié)合促進(jìn)HIF1α的轉(zhuǎn)錄。作者接著運(yùn)用ISH、PLA、螢光素酶及Sp1抑制等實(shí)驗(yàn)證實(shí)了H19可以招募Sp1從而促進(jìn)HIF1α的轉(zhuǎn)錄。
圖9 PLA、螢光素酶及Sp1抑制實(shí)驗(yàn)
另一方面，通過LongTarget tool預(yù)測，H19上存在與HIF1α啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合的區(qū)域。通過去除H19相應(yīng)區(qū)域，H19仍然保留它的促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用，但是喪失促HIF1α轉(zhuǎn)錄的作用。最后，作者通過RNA-ChIP實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了Sp1及H19可以與HIF1α的啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合。
圖10 RNA-ChIP、敲除實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)H19通過招募Sp1促進(jìn)HIF1α的轉(zhuǎn)錄
總結(jié)
同其他文章相比，本文的特色是通過生物信息學(xué)、分子互作技術(shù)對(duì)H19促進(jìn)SMC細(xì)胞凋亡的功能作了研究。在細(xì)胞質(zhì)中，H19通過與HIF1α結(jié)合招募Mdm2降低P53的泛素化，從而促進(jìn)SMC細(xì)胞的凋亡，促進(jìn)腹動(dòng)脈瘤的進(jìn)展；在細(xì)胞核中，H19通過與HIF1α啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合，同時(shí)招募Sp1到啟動(dòng)子區(qū)，從而促進(jìn)HIF1α的轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)SMC細(xì)胞的凋亡，最后促進(jìn)腹動(dòng)脈瘤的進(jìn)展。本文對(duì)H19的功能作了一個(gè)詳實(shí)而全面的研究，為研究疾病相關(guān)的長鏈非編碼RNA提供了一定的思路。