一夫當關(guān)，莫如雙管齊下
——聚焦熱啟動Taq DNA聚合酶雙封閉抗體
當下基于PCR技術(shù)的核酸檢測仍有其應用難點
難點→檢測試劑的穩(wěn)定性
核酸檢測行業(yè)人都格外關(guān)注檢測試劑的穩(wěn)定性，不管是長期儲存穩(wěn)定性還是短期偏離正常保存條件的穩(wěn)定性，都直接影響檢測結(jié)果的有效性。而短期偏離正常保存條件的穩(wěn)定性在實際使用和運輸過程中尤為重要，比如遇到樣本量大、適配自動化、排隊等待上機等情況，反應體系需要在室溫或4℃放置，再比如遇到運輸時間長，溫度難以控制，檢測體系就暴露在風險之下。如何保證穩(wěn)定性，如何確保檢測結(jié)果有效、可信，是行業(yè)關(guān)注的難點。
難點→非特異性擴增
非特異性擴增直接影響檢測結(jié)果的判讀，還消耗反應體系中的引物等物料，導致目的基因擴增失敗。試劑開發(fā)人員通過優(yōu)化引物、調(diào)整鎂離子濃度和酶量、調(diào)整退火溫度等方法避免非特異性擴增，但仍需謹慎操作，稍不留意也會導致檢測失敗。
熱啟動DNA聚合酶可幫助攻克核酸檢測應用難點
目前常用抗體法熱啟動Taq DNA聚合酶幫助提升試劑穩(wěn)定性和解決非特異性擴增問題。傳統(tǒng)的抗體法熱啟動，是利用Taq DNA聚合酶抗體封閉其5'→3'聚合酶活性，防止在低溫時錯配或引物二聚體引起非特異性擴增，在PCR預變性95℃加熱時，抗體蛋白變性，釋放DNA聚合酶活性，不影響正常擴增。利用抗體封閉聚合酶活性，可謂一夫當關(guān)，萬夫莫開。
一夫當關(guān)，莫如雙管齊下——翊圣帶來雙封閉抗體
聚合酶活性封閉抗體可以有效防止錯配引起的非特異性擴增，提升了全預混反應體系的穩(wěn)定性，然而Taq DNA聚合酶除了具有5'→3'聚合酶活性，還有5'→3'核酸外切酶活性，這部分外切酶活性可能會在低溫時導致錯配探針或其它物料降解，造成非特異信號。因此翊圣開發(fā)了雙封閉抗體，不僅可以封閉Taq DNA聚合酶的聚合酶活性，還能同時封閉Taq DNA聚合酶的外切酶活性，雙管齊下，既能有效防止錯配或引物二聚體引起的非特異性擴增，又能防止物料降解產(chǎn)生非特異信號，雙重提升試劑穩(wěn)定性，使檢測試劑在運輸或室溫使用過程中都能夠從容應對。
圖1. 傳統(tǒng)抗體法封閉原理示意圖
圖中高亮部分為Taq DNA聚合酶5'→3'聚合酶活性結(jié)構(gòu)域，抗體只封閉Taq DNA聚合酶的5'→3'聚合酶活性
圖2. 翊圣雙封閉抗體封閉原理示意圖
圖中高亮部分為Taq DNA聚合酶5'→3'聚合酶活性結(jié)構(gòu)域和5'→3'核酸外切酶活性結(jié)構(gòu)域，翊圣雙封閉抗體含兩種抗體，可同時封閉Taq DNA聚合酶的5'→3'聚合酶活性和5'→3'核酸外切酶活性
圖3. 雙封閉抗體外切酶活性封閉效率檢測
設(shè)計引物探針配于反應液中，40℃反應，檢測熒光信號。
黃色為未封閉的Taq DNA聚合酶組
紫色為雙封閉抗體封閉的Taq DNA聚合酶組
由圖3可以看出雙封閉抗體可有效封閉Taq DNA聚合酶的外切酶活性。
雙封閉抗體有效提升檢測試劑穩(wěn)定性
用傳統(tǒng)封閉抗體與雙封閉抗體分別封閉Taq DNA聚合酶，配置成含引物探針的全預混液，在4℃或37℃放置10天或1、3、5天，擴增10000拷貝ASF基因質(zhì)粒，觀察擴增曲線和CT值變化，對比傳統(tǒng)封閉抗體和雙封閉抗體對全預混反應液穩(wěn)定性的作用。
圖4. 傳統(tǒng)封閉抗體封閉反應液擴增10000拷貝ASF基因質(zhì)粒擴增曲線圖
藍色為含引物探針全預混液4℃放置10天后擴增曲線，紅色為4℃放置0天對照
圖5. 雙封閉抗體封閉反應液擴增10000拷貝ASF基因質(zhì)粒擴增曲線圖
藍色為含引物探針全預混液4℃放置10天后擴增曲線，紅色為4℃放置0天對照
由圖4、圖5可以看出，雙封閉抗體比傳統(tǒng)封閉抗體更能保持反應液穩(wěn)定，有效提升檢測試劑穩(wěn)定性。雙封閉抗體封閉含引物探針全預混液4℃放置10天擴增曲線和CT值無明顯變化。
圖6. 傳統(tǒng)封閉抗體封閉反應液擴增10000拷貝ASF基因質(zhì)粒擴增曲線圖
藍色為含引物探針全預混液37℃放置5天后擴增曲線
綠色為含引物探針全預混液37℃放置3天后擴增曲線
黃色為含引物探針全預混液37℃放置1天后擴增曲線
紅色為37℃放置0天對照
圖7. 雙封閉抗體封閉反應液擴增10000拷貝ASF基因質(zhì)粒擴增曲線圖
藍色為含引物探針全預混液37℃放置5天后擴增曲線
綠色為含引物探針全預混液37℃放置3天后擴增曲線
黃色為含引物探針全預混液37℃放置1天后擴增曲線
紅色為37℃放置0天對照
由圖6、圖7可以看出，雙封閉抗體比傳統(tǒng)封閉抗體更能保持反應液穩(wěn)定，有效提升檢測試劑穩(wěn)定性。雙封閉抗體封閉含引物探針全預混液37℃放置1、3、5天CT值差小于0.2。
雙封閉抗體幫助解決基線上漂問題
某些引物配合特定buffer和儀器時，會出現(xiàn)基線上漂的情況。翊圣嘗試多種方法改善基線問題，發(fā)現(xiàn)雙封閉抗體更有利于基線平穩(wěn)。
圖8. N基因擴增曲線圖
紅色為傳統(tǒng)封閉抗體封閉反應液擴增曲線
綠色為雙封閉抗體封閉反應液擴增曲線
圖9. ACT基因擴增曲線圖
紅色為傳統(tǒng)封閉抗體封閉反應液擴增曲線
綠色為雙封閉抗體封閉反應液擴增曲線
由圖8、圖9可以看出特定引物和buffer下，使用雙封閉抗體可幫助解決基線上漂問題。
使用雙封閉抗體獲得良好線性
用雙封閉抗體封閉的反應液擴增100000、10000、1000、100拷貝ASF/ACT雙質(zhì)粒，制作標準曲線。
圖10
地 址： 上海市浦東新區(qū)天雄路166弄一號樓三層南單元 聯(lián)系人： 李自轉(zhuǎn) 電 話： 400-6111-883、021-34615995-8075 傳 真： 021-34615995-188 Email：lizizhuan@yeasen.com
翌圣生物科技（上海）股份有限公司
商家主頁