針對(duì)皮膚組織的構(gòu)成特點(diǎn)，我們采用DNase I和其他類型膠原酶配置特定的混合酶液對(duì)組織進(jìn)行解離，消化前后結(jié)合GentleMacs儀器進(jìn)行研磨，通過機(jī)械輔助降低角質(zhì)層細(xì)胞比例；皮膚樣本細(xì)胞懸液制備中容易出現(xiàn)結(jié)團(tuán)率偏高的情況，我們利用結(jié)團(tuán)細(xì)胞團(tuán)和單個(gè)細(xì)胞間沉降系數(shù)差進(jìn)行離心沉降，輔助解離，降低結(jié)團(tuán)率；對(duì)于碎片較多的樣本，可通過活細(xì)胞染色流式分選來去除碎片和死細(xì)胞，獲得總數(shù)多、活性好、碎片少、成團(tuán)率低的單細(xì)胞懸液；同時(shí)，我們還可根據(jù)客戶的具體需求，針對(duì)皮膚組織的特定類型細(xì)胞進(jìn)行分選。
皮膚組織單細(xì)胞懸液制備
實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/span>
客戶提供新鮮組織樣本（組織保護(hù)液保存），制備細(xì)胞懸液后用于單細(xì)胞測序。
實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備
樣本接收，拍照留存，超凈臺(tái)紫外消毒、備好冰盒冰板，準(zhǔn)備好相應(yīng)酶液。
【酶液】：
1 mg/ml Collagenase IV
3.5 mg/ml Collagenase II
0.04 mg/ml DNase I
0.002 mg/ml hyaluronidase
HBSS
實(shí)驗(yàn)步驟
1. 將組織放入培養(yǎng)皿中，放置在冰板上，加入清洗液，清洗三次；
2. 完全棄去清洗液后，加入少量配制好的酶液，使用干凈的剪刀將組織完全剪碎；
3.待組織完全剪碎后，用移液器將每組剪碎的組織移到15mL離心管內(nèi)，加入足量酶液混勻，取20μl進(jìn)行臺(tái)盼藍(lán)鏡檢；
4.將裝有組織的離心管放置在37oC搖床上消化60min；
5.待消化結(jié)束，將所有消化液轉(zhuǎn)移至離心管，加入足量清洗液，將其通過100μm, 40μm濾網(wǎng)轉(zhuǎn)移至離心管，300×g 離心5min；
6. 加入清洗液，300×g 離心5min；
7. 棄去上清，加入紅細(xì)胞裂解液重懸裂解紅細(xì)胞，裂解時(shí)間3min；
8. 加入清洗液終止裂解并清洗細(xì)胞，300×g 離心5min；
9. 棄上清,加入清洗液繼續(xù)清洗一次后重懸，取20μl懸液進(jìn)行質(zhì)檢；
10.將細(xì)胞加到37% percoll上，400×g，20min,升降速度為1，離心；
11.棄上清，使用清洗液重懸細(xì)胞，分別取20μl進(jìn)行臺(tái)盼藍(lán)染色和AOPI計(jì)數(shù)。
部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果展示
樣本：小鼠皮膚組織
細(xì)胞活率：98.8%
活細(xì)胞濃度：3.6E+05/ml
結(jié)團(tuán)率：4.37%
樣本：人黑色素瘤
細(xì)胞活率：93.27%
活細(xì)胞濃度：2.98E+04/ml
結(jié)團(tuán)率：12.47 %