2020年1月6日，國際頂尖學術期刊 Science 發表了一篇報導：Virus used in gene therapies may pose cancer risk, dog study hints。該報道稱，這項針對狗的血友病的新研究表明，AAV 病毒可以輕易將其攜帶的基因插入到宿主的 DNA 中，并且插入位置靠近調控細胞生長的基因，有誘發癌癥的可能性。
該項研究結果同樣也帶來一個好消息。美國國家人類基因組研究所的基因治療研究員Charles Venditi表示“基因整合到染色體上而不是呈游離狀態，其治療效果會更持久”。正如女王大學（Queen’s University）的物理學家 David Lillicrap 所說，“如果一個蛋白質需要長期表達，那么這種插入是很重要的”。今天小編自問自答整理了關于腺相關病毒(AAV)的十個問題，相信這自問自答的十個問題能說明AAV依然是基因治療明星載體。
1、腺相關病毒(AAV)的不同血清型為什么具有不同的細胞/組織嗜性和轉導效率？
原因是：腺相關病毒(AAV)的這些特性高度依賴于AAV衣殼氨基酸序列，衣殼結構及其與宿主細胞因子的相互作用，包括細胞表面受體，共受體，信號分子，宿主DNA復制中涉及的蛋白質和宿主來源的抗體。
這篇文章講述了有關AAV衣殼和衣殼病毒蛋白區域的當前結構信息，這些蛋白在賦予感染表型的細胞相互作用中起作用，然后用于注釋衣殼的功能區域。根據目前的數據，AAV已經進化出具有保守核心區域的多功能衣殼，這是有效衣殼運輸的必要條件，衣殼裝配和基因組包裝。不同的表面環結構賦予差異受體識別，并參與抗體識別。
2、腺相關病毒(AAV)為什么能長時間表達？特別是一些神經元細胞，持續表達時間甚至可以長達兩年以上。
原因是：腺相關病毒(AAV)基因組在細胞核中的存留主要是以環狀的dsDNA附加體（circularised dsDNA episomes）。AAV基因組在附加體中存續的能力僅依賴于細胞蛋白將線性基因組轉化為穩定的環狀和串聯結構?？梢酝茢噙@些合成的DNA中間體有助于體內長期基因表達。
文章描述了描述了當載體拷貝數達到穩定狀態（即基因轉移后數月）時，非人類靈長類動物骨骼肌中的rAAV載體基因組結構。載體基因組以游離單體和串聯體的形式持續存在，其結構與染色質一致。苯丁酸鈉對之前用rAAV載體肌肉內轉導的靈長類動物的給藥不會增加轉基因的表達，這表明大多數持久性載體基因組都保持著染色質構型，這說明了長期的轉基因表達。與組蛋白同化的rAAV基因組的結構可能開始解釋載體基因組附加體的長期持久性和非分裂組織中的轉基因表達。
3、超過了腺相關病毒(AAV)的包裝容量（AAV的基因組大小小于4.8 kb）還能包裝AAV嗎？
當然是可以的。使用雙AAV載體系統即可以，可以讓包裝容量達到8k。文章“Dual AAV gene therapy for Duchenne muscular dystrophy with a 7kb mini-dystrophin gene in the canine model” 報告了在杜興肌營養不良（DMD）犬模型中使用一對雙AAV載體讓7 kb犬ΔH2-R15小型肌營養不良蛋白基因表達。這項技術讓大基因包裝腺相關病毒(AAV)成為可能。
4、腺相關病毒(AAV)的靶向性/特異性非常好，是如何做到的？
原因是：有幾種不同的措施或者方法可以驅動特定細胞/組織中的基因表達；這些包括啟動子，Flp或Cre依賴性基因開關，以及血清型。如果您打算廣泛表達，那么廣泛活性的啟動子，例如CMV_bGlobin（由CMV啟動子和beta Globin intron組成）是一個不錯的選擇。如果您具有特定的靶細胞類型，則可能需要嘗試其他啟動子，例如Camk2a是特定于神經元的。另一方面，可以將具有Cre或Flip依賴性基因表達的rAAV載體注射到在特定細胞類型中具有Cre或Flp表達的動物中，這樣能過做到僅在這些細胞中表達基因。
5、腺相關病毒(AAV)載體表達時間需要7-14天，還能更快嗎？
答案當然是肯定的。文章“Self-complementary Recombinant Adeno-Associated Virus (scAAV) Vectors Promote Efficient Transduction Independently of DNA Synthesis”通過改造其中的一個ITR使得腺相關病毒(AAV)形成二聚體或自身互補的AAV（稱為scAAV）。與標準單鏈ssAAV相比，scAAV載體顯示起效快和更高水平的轉基因表達。這種序列的優點在于它不需要單鏈DNA復制成為雙鏈DNA的步驟就可以進行轉錄，與傳統的單鏈AAV基因組相比，它的基因表達更為迅速，而且表達量更高。但是，它們的包裝容量（<2.5Kb）是ssAAV的一半（<4.8Kb），限制了可以成功包裝的基因和載體可以有的調控元件的數量。
6、腺相關病毒(AAV)相比其他基因遞送工具比如慢病毒和腺病毒更適合動物實驗，那如何保證動物實驗的效果呢？
病毒滴度非常重要。可以決定傳遞到組織的病毒顆粒的數量取決于病毒制備的滴度和可以傳遞的最大體積，這一點非常重要。您可以先從文獻中搜索有關特定組織的建議，但是，通常需要通過嘗試一系列稀釋來確定體內實驗最佳劑量，其次還有動物的年齡，觀察時間，以及注射方式方法都會影響動物實驗的效果。
7、腺相關病毒(AAV)都有方面的應用，適合哪些組織？
腺相關病毒(AAV)載體在骨骼肌基因治療，肝臟基因治療，中樞神經系統基因治療，視網膜退行性疾病的基因治療以及心臟相關疾病的基因治療等方面都有應用。
8、腺相關病毒(AAV)可以用于基因組編輯嗎？
SaCas9（Staphylococcus aureus Cas9）的出現使腺相關病毒(AAV)用于基因組編輯成為可能。研究證實SaCas9產生的Indel的效率與SpCas9相似。文章“In Vivo Genome Editing Using Staphylococcus Aureus Cas9” 將SaCas9及其單個sgRNA表達盒包裝到單個AAV載體中，并靶向小鼠肝臟中的膽固醇調節基因Pcsk9。在注射后的一周內觀察到了>40％的基因修飾，同時血清Pcsk9和總膽固醇水平顯著降低。文章使用BLESS進一步評估了SaCas9和SpCas9的全基因組靶向特異性，證明了SaCas9介導的體內基因組編輯具有高效和特異性的潛力。
9、腺相關病毒(AAV)臨床應用情況
迄今為止，AAV載體AAV1，AAV-2，AAV-6，AAV-7，AAV-8，AAV-9和AAVrh10已用于超過183個基因治療試驗中。這些臨床試驗針對的疾病包括但不限于B型血友病，LPL缺乏癥，囊性纖維化，肌營養不良，帕金森氏病和HIV。
10、腺相關病毒(AAV)挑戰有哪些？
（1）預先存在的免疫力：許多人體內已經有野生型AAV，因此可能已經有了預防AAV感染的方法。這些預先存在的抗體可能會干擾病毒與細胞的相互作用，并嚴重阻礙基因治療的結果。
（2）免疫系統生成的抗AAV抗體：患者自身的免疫系統可以生成抗體，以中和用于治療它們的AAV載體?？茖W家正在努力通過直接進化，衣殼改組和肽展示來開發新的衣殼來克服這個問題。新的衣殼這些衣殼將會具有逃避免疫系統的能力和增強的感染靶組織的能力。通過控制基因表達和選擇特異性啟動子提高特異性，也可能有助于AAV載體逃避宿主免疫。
結語
腺相關病毒(AAV)是之所以作為基因治療明星載體，因為：1）它們的基因組易于操作，2）它們能夠長期表達； 3）毒性有限。然而，使用AAV進行神經科學研究的關鍵挑戰是缺乏一種操縱整個大腦神經元的方法。CNS的周圍神經系統（PNS）連接到心臟，肺，腸和其他器官的神經元，也是基因傳遞的重要目標，尤其是對疼痛的研究。吉凱基因有特異子庫，涉及心臟，血管，肝臟，骨骼，肌肉，神經，眼睛，脂肪，胰腺等不同組織的啟動子，同時開發整理針對特定組織的特異性血清型，歡迎前來咨詢。
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