編者按

 代謝性脂肪肝?。∕AFLD）已成為當今最廣泛的代謝性疾病之一，其主要誘因是肝臟過度脂質沉積和脂肪酸代謝過載引起的細胞氧化應激。AMP活化蛋白激酶（AMPK）是細胞能量代謝的關鍵感受器。在肝細胞中，AMPK的激活會反過來促進細胞內溶酶體相關的自噬進程，吞噬多余脂質，起到“一石二鳥”的作用，因此，溶酶體AMPK途徑是增強MAFLD治療效果的潛在靶標。

今天，我們分享2024年8月21日由安徽大學材料科學與工程學院畢紅教授課題組在期刊 Advanced Functional Materials（IF=18.5）上發表的一項研究成果——“Two Birds with One Stone: Guanidyl Carbon Dots with Enhanced Antioxidative and Lipolytic Functions in Metabolic Associated Fatty Liver”，該研究利用斑馬魚MAFLD模型，基于藥效團融合策略，設計開發了一種由二甲雙胍和茶多酚反應合成的新型生物功能性碳點（MTCDs），該碳點表面保留了源自反應物的酚羥基和胍基，旨在減少肝臟中的脂質沉積和氧化應激。

進一步研究表明，采用MTCDs可保護溶酶體免受氧化應激損傷，并激活肝細胞AMPK信號，從而啟動脂代謝和脂噬進程，加速脂肪分解和脂質消耗。因此，它可以作為一種有效的“一石二鳥”的MAFLD協同治療工具，為多效藥物的開發提供了一種新的策略。

文章題目

Two Birds with One Stone: Guanidyl Carbon Dots with Enhanced Antioxidative and Lipolytic Functions in Metabolic Associated Fatty Liver

雜志：Advanced Functional Materials（IF=18.5）

發表時間：2024年8月21日

作者：蔡皓、李子健副教授、畢紅教授等

單位：安徽大學材料科學與工程學院

項目資助：由國家自然科學基金（52172033）和國家重點研發計劃（批準號：2021YFA1600202）的資助；得到了安徽大學雜化材料結構與功能調控教育部重點實驗室、安徽省綠色高分子材料重點實驗室（安徽大學）的支持

圖1. MTCDs的（a）合成示意圖及(b)其促進脂代謝、改善MAFLD的潛在機制

01、研究背景

代謝性脂肪肝病（MAFLD）已成為當今最廣泛的代謝性疾病之一，其主要誘因是肝臟過度脂質沉積和脂肪酸代謝過載引起的細胞氧化應激。然而，由于目前的藥物臨床實驗效果不理想，迄今為止，美國食品和藥物管理局（FDA）或其他任何監管機構都沒有批準針對MAFLD的特異性藥物。

AMP活化蛋白激酶（AMPK）是細胞能量代謝的關鍵感受器，AMPK的活化能夠加速細胞線粒體代謝、促進脂肪分解。值得注意的是，AMPK的激活需要溶酶體的參與，例如，一種經典的激動劑二甲雙胍通過溶酶體PEN2蛋白來活化AMPK信號。在肝細胞中，AMPK的激活還會反過來促進細胞內溶酶體相關的自噬進程，吞噬多余脂質，起到“一石二鳥”的作用。因此，溶酶體AMPK途徑是增強MAFLD治療效果的潛在靶標。

本研究中，安徽大學材料科學與工程學院畢紅教授團隊以二甲雙胍和茶多酚為前驅體，制備了表面富含胍基和酚羥基且具有溶酶體靶向功能的碳點納米藥物（命名為MTCDs），用以突破現有MAFLD治療的瓶頸。其中，胍基用于激活肝細胞AMPK信號，促進脂代謝，而酚羥基則使得碳點具備抗氧化能力。通過改變前驅物的投料比，調節所制備的MTCDs的表面性質及zeta電位，使之可以大量富集在肝細胞的溶酶體中，保護溶酶體免收氧化應激損傷。

此外，研究人員在斑馬魚中建立了MAFLD模型，并與MTCDs樣品共孵育，以研究MTCDs在體內的藥理作用。實驗結果表明，MTCDs通過激活溶酶體AMPK信號，一方面可以促進肝細胞脂代謝，另一方面可以促進溶酶體相關的脂噬作用，增強對MAFLD的治療作用。

02、主要研究成果

1.  MTCDs保留了前驅體亞甲基藍和二甲雙胍的部分功能基團（如酚羥基和胍基）

透射電鏡圖像（TEM，圖2a）顯示MTCDs粒子尺寸分布均勻，平均粒徑為2.0 nm，碳核結晶性較好，其中晶面間距為典型的0.21 nm（圖2a內插圖）。原子力顯微鏡（AFM）測得MTCDs粒子的平均高度為2.3 nm（圖2b），其X-射線粉末衍射（XRD）在22°處亦出現一個寬峰（圖2c）。拉曼光譜在1415 cm−1（D帶）和1611 cm−1（G帶）信號的強度比為0.65（圖2d）。

圖2. MTCDs的(a)TEM圖像，右插圖為其尺寸分布，左上角插圖為經過FFT處理后的碳核的高分辨TEM圖像；(b) AFM圖像；(c) XRD；(d)拉曼光譜；(e) FT-IR光譜；(f) XPS能譜以及(g) C1s；(h) O1s和(i) N1s高分辨XPS譜圖。

紅外光譜（FT-IR）顯示有O−H (3400 cm−1)、C=N/C=C (1627 cm−1)和C−N (1125 cm−1)的振動峰（圖2e），說明碳點表面可能存在胍基和酚羥基。X-射線光電子能譜（XPS，圖2f）顯示其中C、O和N元素的原子百分比分別為71.63 %、18.29 %和10.08 %，進而，高分辨C 1s XPS譜圖（圖2g）可分峰為C=C/C−C (284.78 eV)、C−O/C−N (285.95 eV)和C=O/C=N (288.10 eV)，高分辨O 1s XPS譜圖（圖2h）可分峰為C−O (532.60 eV)和C=O (531.15 eV)，高分辨N1s XPS譜圖（圖2i）可分成399.20 eV、400.35 eV和401.95 eV三個峰，分別歸屬為吡啶N、吡啶N和氨基N。

以上結果表明，反應產物MTCDs保留了前驅體亞甲基藍和二甲雙胍的部分功能基團（如酚羥基和胍基）。

2. 熒光共定位實驗結果表明MTCDs可能大量富集在細胞溶酶體中

圖3a紫外-可見吸收光譜顯示MTCDs在水溶液中從紫外到可見光區均有吸收，其中在200-250 nm是碳點典型的紫外強吸收峰，一般認為是碳核態的π−π*躍遷所致，而在250-314 nm之間的紫外吸收與前驅體之一茶多酚的吸收峰位置相近，可歸屬于碳點表面酚羥基的n−π*躍遷，這說明前驅體的殘留基團對MTCDs表面的發光中心有貢獻。

圖3. (a) MTCDs在水溶液中的紫外-可見吸收、激發和熒光光譜。(b) HepG2細胞與MTCDs共孵育0.5 h，1 h，2 h和3 h后的CLSM圖片，標尺= 50 μm。(c)不同內吞抑制劑（2-DG、CPZ、GEN）處理的HepG2細胞與MTCDs共孵育后的CLSM圖片，標尺= 50 μm。(d)分別經 MTCDs、Lyso-tracker和Mito-tracker染色后的HepG2細胞CLSM圖片及對應的熒光強度曲線，標尺= 50 μm。

此外，該碳點在314-600 nm光譜范圍內仍然有一定程度的吸收，其在可見光區（400-600 nm）的吸收不可忽視。由圖3a可見，在藍光（激發波長為435 nm）激發下，MTCDs水溶液呈現青色熒光。進而借助于激光共聚焦顯微鏡（CLSM），觀察到MTCDs可以在3小時內被肝細胞攝取（圖3b）。

然而，當采用三磷酸腺苷合成抑制劑2-脫氧-d -葡萄糖（2-DG）或網格蛋白介導的內吞抑制劑氯丙嗪（CPZ）處理肝細胞，會抑制MTCDs被細胞攝取的進程，降低細胞的熒光強度（圖3c），但小泡介導的內吞抑制劑染料木素（GEN）處理對肝細胞攝取MTCDs后的熒光強度沒有影響（圖3c），由此推論MTCDs的細胞內化途徑主要是能量依賴型的內吞作用，且網格蛋白參與其中。

曾有文獻報道網格蛋白介導的內吞作用促進了碳點在溶酶體中的定位，在本研究中，熒光共定位實驗結果顯示肝細胞經MTCDs染色的綠色熒光與商用溶酶體探針（Lyso-tracker）的紅色熒光重疊良好（圖3d），表明MTCDs可能大量富集在細胞溶酶體中。

3. MTCDs具有良好的ROS清除能力和降脂抗氧化功能

隨后，作者對MTCDs的抗氧化降脂能力進行了研究。在肝細胞中用油酸和棕櫚酸誘導了體外MAFLD模型。如圖4a所示，與空白對照組相比，經油酸和棕櫚酸處理后的肝細胞中ROS熒光探針的信號增強，但是加入MTCDs的組減弱了這種信號增強。

鑒于MTCDs在溶酶體中富集，作者還研究了MTCDs對過量氧化應激誘導的溶酶體損傷的保護作用。染料吖啶橙（AO）在溶酶體的酸性微環境中可以發出明亮的紅色熒光，但受損的溶酶體完整性和酸度降低，因此紅色熒光會減弱。作者發現油酸和棕櫚酸處理降低了肝細胞的紅色熒光強度，而與MTCDs或TP共孵育顯著逆轉了這種降低趨勢（圖4b），該結果表明MTCDs可以保護溶酶體免受這種氧化應激損傷。

此外，油酸和棕櫚酸處理也增加了肝細胞中脂質過氧化標志物丙二醛（MDA）的表達，同時降低了抗氧化標志物超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽（GSH）的表達。然而，MTCDs的加入逆轉了這些改變（圖4c-e）。

圖4. (a) 經油酸、棕櫚酸和不同濃度MTCDs分別處理后的HepG2細胞內ROS的熒光圖像及相應的流式分析，標尺= 100 μm。(b) 經油酸、棕櫚酸、MTCDs和TP處理后的HepG2細胞的AO染色（標尺= 50 μm）以及胞內(c) MDA、(d) SOD、(e) GSH的含量 (n = 6)。經油酸、棕櫚酸和MTCDs分別處理后的HepG2細胞的(f)尼羅紅、DAPI、Oil red O染色（標尺= 100 μm）、(g)總TG含量(n = 6)和(h, i)細胞培養液中ALT和AST的水平(n = 6)。數據以均數±SEM表示; * * p < 0.05, * * p < 0.01和* * * p < 0.001。

除了氧化應激外，過量的脂質沉積是MAFLD的另一個病理特征。如圖4f所示，油酸和棕櫚酸誘導組肝細胞的脂滴明顯多于對照組，但加入MTCDs組減少了相應的脂質沉積，而且總甘油三酯（TG）的定量檢測結果也顯示出與脂滴染色相同的變化（圖4g）。

此外，油酸和棕櫚酸處理增加了培養基中肝損傷標志物丙氨酸轉氨酶（ALT）和天冬氨酸轉氨酶（AST）的含量，提示細胞膜受損（圖4h和4i），但加入MTCDs組培養基中ALT和AST的含量降低(圖4h和4i)。

上述結果表明，MTCDs具有良好的ROS清除能力和降脂抗氧化功能。

4. MTCDs對MAFLD的改善作用的潛在機制研究

研究人員進一步探討了MTCDs對MAFLD的改善作用的潛在機制。如圖5a，b所示，油酸和棕櫚酸處理降低了AMPK催化亞基AMPKα1在肝細胞中的磷酸化水平，而加入MTCDs逆轉了這種降低趨勢，但使用AMPK抑制劑復合物C（簡寫為C.C）可以消除這種逆轉作用，表明富集在溶酶體中的MTCDs在保護溶酶體功能的同時激活了AMPK信號，從而促進溶酶體相關的自噬，這是一種細胞防御和應激調節機制。

此外，P62和LC3作為自噬體的關鍵組成蛋白，分別與自噬通量呈負相關和正相關。如圖5a, c和d所示，油酸和棕櫚酸處理組的細胞與對照組相比，P62的表達更高，LC3Ⅰ/Ⅱ的比值更低，而加入MTCDs組逆轉了這些變化，上述結果表明MTCDs可以通過AMPK介導的方式啟動細胞自噬進程。

圖5. HepG2細胞分別經油酸+棕櫚酸、MTCDs和C.C處理之后，(a)細胞中P62、LC3Ⅰ/Ⅱ和AMPKα1磷酸化水平的免疫印跡，(b)磷酸化的AMPKα1與總AMPKα1， (c) P62與β-actin， (d) LC3Ⅱ與LC3Ⅰ的比值(n = 6)以及(e)尼羅紅和MDC染色，標尺= 100 μm。(f) HepG2細胞電鏡圖像，標尺= 1 μm。(g) Atgl、(h) Hsl、(i) Pgc-1α、(j) Cpt1a 的mRNA相對表達量(n = 6)。數據以均數±SEM表示; * * p < 0.05, * * p < 0.01, 和* * * p < 0.001。

為了探究自噬與脂質減少之間的關系，作者研究了MTCDs誘導AMPK活化過程中的脂質吞噬，并采用丹酰尸胺（MDC）作為熒光探針來直觀地反映熒光圖像中的自噬水平。如圖5e所示，油酸和棕櫚酸處理增強了肝細胞中MDC的熒光強度，但降低了尼羅紅的熒光強度，然而加入MTCDs組逆轉了這些變化，該結果表明自噬水平與脂質沉積呈負相關。細胞電鏡結果（圖5f）也顯示自噬體總量的變化趨勢與MDC熒光成像結果相似。

值得注意的是，肝與MTCDs共孵育后，伴隨著自噬體的增加，脂滴周圍的自噬體數量也增加了（圖5f中用紅色箭頭突出）。以上數據表明MTCDs會啟動AMPK介導的脂質吞噬，消耗肝細胞中多余的脂質沉積。

最后，作者對脂代謝相關基因進行了監測，在油酸和棕櫚酸處理的肝細胞中，隨著脂噬的增加，MTCDs提高了脂肪分解（Atgl和Hsl）和脂肪酸氧化（Pgc-1α和Cpt1a）的基因表達（圖5g-j），證明MTCDs通過激活AMPK信號通路促進肝細胞脂代謝。

5. 利用斑馬魚MAFLD模型來研究MTCDs在體內的藥理作用

近年來，斑馬魚已成為體內脂肪肝研究的廣泛而充分的模型，涵蓋了生物醫學、細胞生物學、生物材料等研究領域。在本研究中，研究人員在斑馬魚中建立了MAFLD模型，并與MTCDs樣品共孵育，以研究MTCDs在體內的藥理作用。

圖6a熒光圖像顯示，MTCDs可以進入斑馬魚的胚胎，并在斑馬魚幼蟲的肝臟、胃和腸道等代謝消化系統中富集。將5 dpf斑馬魚幼魚在含有2 mg mL-1蛋黃粉和3%葡萄糖(w/v)的E3緩沖液（簡稱HF）中孵育2周作為對照組，與此同時，在HF緩沖液中加入不同濃度的MTCDs與斑馬魚共孵育作為實驗組。如圖6b-d所示， MTCDs逆轉了HF飲食誘導的斑馬魚MDA增加的同時SOD和GSH減少的趨勢，這與MTCDs在細胞中的抗氧化特性相一致。

圖6. (a) MTCDs孵育組的斑馬魚胚胎和幼蟲的CLSM，標尺= 100 μm。用蛋黃粉和葡萄糖飼喂斑馬魚幼魚2周，在此期間添加了不同劑量的MTCDs，測得斑馬魚中(b)丙二醛(MDA)、(c)超氧化物歧化酶(SOD)和(d) GSH濃度(n=30)。(e)斑馬魚幼魚經蘇木精和油紅O染色，肝臟用紅色虛線突出，標尺= 100 μm。(f)斑馬魚幼魚尼羅紅染色，肝臟以白色虛線突出顯示，標尺= 100 μm。(g)斑馬魚幼魚總TG含量(n = 30)。(h)斑馬魚幼體P62和LC3Ⅰ/Ⅱ免疫印跡。(i) P62與β-actin和(j) LC3Ⅱ與LC3Ⅰ的比值(n = 8)。數據以均數±SEM、Mann-Whitney檢驗的單因素方差分析表示;* * p < 0.05, * * p < 0.01, 和* * * p < 0.001。

此外，油紅O和尼羅河紅染色結果（圖6e和6f）顯示，盡管HF飲食誘導了肝臟中過量的脂質沉積，但加入200 mg mL-1和400 mg mL-1 MTCDs組均改善了斑馬魚的脂質積累。同樣，斑馬魚幼魚總甘油三酯（TG）含量的定量檢測結果顯示脂質沉積的變化趨勢與脂質染色的相似（圖6g）。

由于自噬蛋白高度保守，作者還檢測了P62和LC3在斑馬魚肝臟中的表達。如圖6h-j所示，研究結果表明MTCDs降低了HF飲食誘導斑馬魚的P62表達，增加了LC3Ⅰ/Ⅱ的比值，提示其肝臟的自噬通量和脂噬增強。

總的來說，以上數據表明MTCDs通過AMPK信號通路促進了脂質代謝，從而改善HF飲食誘導的MAFLD。

03、編者點評

綜上所述，本研究基于藥效團融合策略，設計開發了一種由二甲雙胍和茶多酚反應合成的新型生物功能性碳點（MTCDs）。該碳點表面保留了源自反應物的酚羥基和胍基，旨在減少肝臟中的脂質沉積和氧化應激。此外，通過對表面電荷的精細控制，MTCDs具有良好的溶酶體靶向功能和生物相容性，而且生物毒性很低。進一步研究表明，采用MTCDs可保護溶酶體免受氧化應激損傷，并激活肝細胞AMPK信號，從而啟動脂代謝和脂噬進程，加速脂肪分解和脂質消耗。

總的來說，這項工作提出了一種有效的“一石二鳥”的MAFLD協同治療工具，并為多效藥物的開發提供了一種新的策略。

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