實驗設計對于高通量組學數據分析尤為重要。在轉錄組學研究中，小樣本量（eg：實驗組vs對照組）的實驗設計，通過分析兩組間的差異得到不同條件下的差異基因，可以解釋單因素帶來的影響。但對于連續變化的生命進程發展趨勢，則代表意義有限。這就要求研究者們利用大樣本量建立轉錄組分析數據庫。在多組別的轉錄組實驗設計中，設置不同處理梯度，（濃度或時間），進行多組比較分析，可以有效的挖掘基因的表達規律，揭示復雜生物學現象背后的機理。

隨著多組別實驗的開展，不僅可以提供兩組之間的差異信息，同時也可以呈現生命活動的動態變化趨勢，從而幫助研究者在一個實驗中獲取更加全面的數據信息。但多組別實驗的數據量較大，分析時更為復雜。如果沒有合適的分析手段，那么數據挖掘會陷入僵局。那如何更加有效地利用大樣本量轉錄組數據發文呢？下面的篇幅就交給小編，帶您從雜亂無章的轉錄組數據中抽絲剝繭，撥開迷霧見青天。

#01 趨勢分析

趨勢分析，也叫趨勢聚類，顧名思義就是在不同梯度樣本中對具有相同變化模式或者趨勢的變量進行歸類。通常趨勢分析包含梯度和實驗變量兩個維度數據。這里的梯度，可以是不同的處理時間、藥物濃度/劑量、疾病惡化程度、生長周期等；而變量，則是隨著梯度條件不同生物體狀態所發生變化的對象，如基因的表達量。這樣的解釋難免顯得晦澀，小編深知，實踐是檢驗真理的唯一標準，我們一起來看一個案例，揭開趨勢分析的神秘面紗。

玉米轉化高度基于胚愈傷組織的形成，胚愈傷組織主要來源于未成熟玉米胚的盾片細胞。然而，在玉米中僅鑒定出少數幾個與愈傷組織誘導有關的基因。為了揭示與玉米愈傷組織誘導有關的潛在基因，文章對含有2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D）培養基上培養0、1、2、4、6和8天的玉米胚胎進行了RNA測序。在這篇文章中，隨著實驗組別的增加，數據量也是不斷的增加，為了獲得關鍵數據，作者利用趨勢分析對數據進行了深度挖掘，將數據分成8個cluster，分別對這8個cluster進行富集分析，發現cluster2和3中的基因顯示與愈傷組織的形成有關，然后結合轉錄因子分析，進一步闡明cluster2中的ZmBBM2基因是玉米愈傷組織形成過程中的關鍵因子，再通過轉基因實驗驗證，文章輕松到手。從這篇文章中可以看出，面對如此龐大的轉錄組數據分析，趨勢分析在整個數據挖掘過程中起著舉足輕重的作用[1]。

#02 Upset plot

在轉錄組數據分析過程中，經常需要針對某幾組樣本進行共有和特有基因的可視化展示，基于此需求，通?？梢赃x擇Venn分析進行可視化展示。然而，當我們需要分析的樣本分組信息過多，Venn分析就無法有效的展示出不同分組之間共有和特有的基因信息。面對這樣的問題，【中科新生命】推出可視化神包—Upset，以解決多組別之間共性與特性基因集的分析需求。

RNA-Seq越來越多地用于在全基因組范圍內測量人類RNA的表達?？梢酝ㄟ^獲得基因的表達譜以鑒定和對治療反應性基因進行功能表征。最終，此類研究有望揭示有關治療效果的分子機制的見解，識別生物標志物，并實現個性化醫學。在本文中，作者從三價流感疫苗（TIV）接種之前和TIV疫苗接種后10個時間點的5名受試者收集的外周血單核細胞（PBMC）和B細胞樣品中提取的RNA，擬發現TIV疫苗接種后PBMC和B細胞中的關鍵轉錄事件。文章首先通過差異分析，鑒定在疫苗接種后的每一天與疫苗接種前相比的差異基因，對于這兩種細胞類型，大多數差異基因在接種疫苗前均被上調，為了更加有效的展示比較組之間共有和特有差異基因，文章采用Upset進行集合的可視化，更加直觀的揭示疫苗接種前后的差異變化。隨后針對upset篩選出的兩種細胞類型共有和特有基因集進行功能富集分析，兩種細胞類型在多個與細胞周期相關的途徑中富集，包括Reactome細胞周期的有絲分裂，細胞周期和DNA復制等?；谠撃K的富集結果證實了細胞周期相關模塊的富集，揭示了PBMC和B細胞的增殖特征[2]。

各位看官，以上的分享是否為您的實驗設計帶來了些靈感？如果您想了解更多玩轉多組別組學數據的方法，趕緊聯系我們吧！

參考文獻
[1] Du X , Fang T , Liu Y , et al. Transcriptome Profiling Predicts New Genes to Promote Maize Callus Formation and Transformation[J]. Frontiers in Plant Science, 2019, 10:1633.
[2] Jensen T L , Frasketi M , Conway K , et al. RSEQREP: RNA-Seq Reports, an open-source cloud-enabled framework for reproducible RNA-Seq data processing, analysis, and result reporting[J]. F1000research, 2017, 6:2162.


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