實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)對于高通量組學(xué)數(shù)據(jù)分析尤為重要。在轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究中，小樣本量（eg：實(shí)驗(yàn)組vs對照組）的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，通過分析兩組間的差異得到不同條件下的差異基因，可以解釋單因素帶來的影響。但對于連續(xù)變化的生命進(jìn)程發(fā)展趨勢，則代表意義有限。這就要求研究者們利用大樣本量建立轉(zhuǎn)錄組分析數(shù)據(jù)庫。在多組別的轉(zhuǎn)錄組實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中，設(shè)置不同處理梯度，（濃度或時(shí)間），進(jìn)行多組比較分析，可以有效的挖掘基因的表達(dá)規(guī)律，揭示復(fù)雜生物學(xué)現(xiàn)象背后的機(jī)理。
隨著多組別實(shí)驗(yàn)的開展，不僅可以提供兩組之間的差異信息，同時(shí)也可以呈現(xiàn)生命活動(dòng)的動(dòng)態(tài)變化趨勢，從而幫助研究者在一個(gè)實(shí)驗(yàn)中獲取更加全面的數(shù)據(jù)信息。但多組別實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)量較大，分析時(shí)更為復(fù)雜。如果沒有合適的分析手段，那么數(shù)據(jù)挖掘會(huì)陷入僵局。那如何更加有效地利用大樣本量轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)發(fā)文呢？下面的篇幅就交給小編，帶您從雜亂無章的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中抽絲剝繭，撥開迷霧見青天。
#01 趨勢分析
趨勢分析，也叫趨勢聚類，顧名思義就是在不同梯度樣本中對具有相同變化模式或者趨勢的變量進(jìn)行歸類。通常趨勢分析包含梯度和實(shí)驗(yàn)變量兩個(gè)維度數(shù)據(jù)。這里的梯度，可以是不同的處理時(shí)間、藥物濃度/劑量、疾病惡化程度、生長周期等；而變量，則是隨著梯度條件不同生物體狀態(tài)所發(fā)生變化的對象，如基因的表達(dá)量。這樣的解釋難免顯得晦澀，小編深知，實(shí)踐是檢驗(yàn)真理的唯一標(biāo)準(zhǔn)，我們一起來看一個(gè)案例，揭開趨勢分析的神秘面紗。
玉米轉(zhuǎn)化高度基于胚愈傷組織的形成，胚愈傷組織主要來源于未成熟玉米胚的盾片細(xì)胞。然而，在玉米中僅鑒定出少數(shù)幾個(gè)與愈傷組織誘導(dǎo)有關(guān)的基因。為了揭示與玉米愈傷組織誘導(dǎo)有關(guān)的潛在基因，文章對含有2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D）培養(yǎng)基上培養(yǎng)0、1、2、4、6和8天的玉米胚胎進(jìn)行了RNA測序。在這篇文章中，隨著實(shí)驗(yàn)組別的增加，數(shù)據(jù)量也是不斷的增加，為了獲得關(guān)鍵數(shù)據(jù)，作者利用趨勢分析對數(shù)據(jù)進(jìn)行了深度挖掘，將數(shù)據(jù)分成8個(gè)cluster，分別對這8個(gè)cluster進(jìn)行富集分析，發(fā)現(xiàn)cluster2和3中的基因顯示與愈傷組織的形成有關(guān)，然后結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子分析，進(jìn)一步闡明cluster2中的ZmBBM2基因是玉米愈傷組織形成過程中的關(guān)鍵因子，再通過轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證，文章輕松到手。從這篇文章中可以看出，面對如此龐大的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析，趨勢分析在整個(gè)數(shù)據(jù)挖掘過程中起著舉足輕重的作用[1]。
#02 Upset plot
在轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析過程中，經(jīng)常需要針對某幾組樣本進(jìn)行共有和特有基因的可視化展示，基于此需求，通常可以選擇Venn分析進(jìn)行可視化展示。然而，當(dāng)我們需要分析的樣本分組信息過多，Venn分析就無法有效的展示出不同分組之間共有和特有的基因信息。面對這樣的問題，【中科新生命】推出可視化神包—Upset，以解決多組別之間共性與特性基因集的分析需求。
RNA-Seq越來越多地用于在全基因組范圍內(nèi)測量人類RNA的表達(dá)。可以通過獲得基因的表達(dá)譜以鑒定和對治療反應(yīng)性基因進(jìn)行功能表征。最終，此類研究有望揭示有關(guān)治療效果的分子機(jī)制的見解，識別生物標(biāo)志物，并實(shí)現(xiàn)個(gè)性化醫(yī)學(xué)。在本文中，作者從三價(jià)流感疫苗（TIV）接種之前和TIV疫苗接種后10個(gè)時(shí)間點(diǎn)的5名受試者收集的外周血單核細(xì)胞（PBMC）和B細(xì)胞樣品中提取的RNA，擬發(fā)現(xiàn)TIV疫苗接種后PBMC和B細(xì)胞中的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄事件。文章首先通過差異分析，鑒定在疫苗接種后的每一天與疫苗接種前相比的差異基因，對于這兩種細(xì)胞類型，大多數(shù)差異基因在接種疫苗前均被上調(diào)，為了更加有效的展示比較組之間共有和特有差異基因，文章采用Upset進(jìn)行集合的可視化，更加直觀的揭示疫苗接種前后的差異變化。隨后針對upset篩選出的兩種細(xì)胞類型共有和特有基因集進(jìn)行功能富集分析，兩種細(xì)胞類型在多個(gè)與細(xì)胞周期相關(guān)的途徑中富集，包括Reactome細(xì)胞周期的有絲分裂，細(xì)胞周期和DNA復(fù)制等。基于該模塊的富集結(jié)果證實(shí)了細(xì)胞周期相關(guān)模塊的富集，揭示了PBMC和B細(xì)胞的增殖特征[2]。
各位看官，以上的分享是否為您的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)帶來了些靈感？如果您想了解更多玩轉(zhuǎn)多組別組學(xué)數(shù)據(jù)的方法，趕緊聯(lián)系我們吧！
參考文獻(xiàn)
[1] Du X , Fang T , Liu Y , et al. Transcriptome Profiling Predicts New Genes to Promote Maize Callus Formation and Transformation[J]. Frontiers in Plant Science, 2019, 10:1633.
[2] Jensen T L , Frasketi M , Conway K , et al. RSEQREP: RNA-Seq Reports, an open-source cloud-enabled framework for reproducible RNA-Seq data processing, analysis, and result reporting[J]. F1000research, 2017, 6:2162.
轉(zhuǎn)錄測序服務(wù)介紹
