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技術革新：聚焦翌圣生物熱啟動Taq酶雙封閉抗體

非特異擴增是PCR實驗中的常見問題，非特異擴增直接影響檢測結果的判讀并且會導致擴增靈敏度下降，甚至目標片段的得率下降等。此外，檢測試劑的穩定性也是核酸檢測行業人格外關注的問題，不管是長期儲存穩定性還是短期偏離正常保存條件的穩定性，都直接影響檢測結果的有效性。

翌圣生物科技（上海）股份有限公司（以下簡稱“翌圣生物”）匠心開發出熱啟動Taq酶雙封閉抗體，通過同時封閉Taq酶的聚合酶活性及外切酶活性來有效提高擴增的特異性及試劑的穩定性。

傳統的Taq DNA聚合酶抗體可以有效抑制Taq酶的聚合酶活性，從而避免錯配或引物二聚體引起的非特異性擴增。然而Taq酶除了具有5'→3'聚合酶活性，還有5'→3'核酸外切酶活性，這部分外切酶活性可能會在低溫時導致錯配探針或其它物料降解，造成非特異信號。翌圣生物開發的熱啟動Taq酶雙封閉抗體不僅可以封閉Taq酶的有5'→3'聚合酶活性，還能同時封閉Taq酶的5'→3'外切酶活性，雙管齊下，既能有效防止錯配或引物二聚體引起的非特異性擴增，又能防止物料降解產生非特異信號，雙重提升試劑的穩定性。

圖1. 翌圣雙封閉抗體封閉原理示意圖

圖中高亮部分為Taq DNA聚合酶5'→3'聚合酶活性結構域和5'→3'核酸外切酶活性結構域，翌圣雙封閉抗體含兩種抗體，可同時封閉Taq DNA聚合酶的5'→3'聚合酶活性和5'→3'核酸外切酶活性

翌圣生物Taq酶雙封閉抗體不僅可封閉野生型Taq酶，對于多種突變體Taq酶亦可適用，封閉之后的熱啟動Taq酶可以正常保存至-20℃。

1 μL抗體（5 mg/mL）可封閉20-50 U Taq DNA聚合酶：

? 小樣室溫（25℃）旋轉混勻孵育30 min

? 大樣室溫（25℃）旋轉混勻孵育2~3 h

1 雙封閉抗體有效封閉Taq DNA聚合酶外切酶活性

將合成的引物探針分別配于未封閉以及雙封閉抗體封閉的Taq DNA聚合酶的反應液中，40℃反應，檢測兩者熒光信號。

圖2. 雙封閉抗體外切酶活性封閉效率檢測

黃色：未封閉的Taq DNA聚合酶組；紫色：雙封閉抗體封閉的Taq DNA聚合酶組

由圖2可以看出雙封閉抗體可有效封閉Taq DNA聚合酶的外切酶活性。

2 使用雙封閉抗體分型準確，靈敏度更高

分別用翌圣生物雙封閉抗體以及T公司抗體對Taq酶封閉后通過ARMS-PCR技術檢測陽性樣本。

圖3. ARMS-PCR擴增曲線圖

藍色：T公司封閉抗體封閉；紅色：翌圣雙封閉抗體封閉

由圖3可以看到翌圣生物雙封閉抗體封閉的Taq酶在ARMS-PCR擴增中分型準確，靈敏度更高。

3 雙封閉抗體有效提升檢測試劑穩定性

用傳統封閉抗體與雙封閉抗體分別封閉Taq DNA聚合酶，配置成含引物探針的全預混液，在4℃放置10天或在37℃放置1、3、5天，擴增10000拷貝ASFV質粒，觀察擴增曲線和Ct值變化，對比傳統封閉抗體和雙封閉抗體對全預混反應液穩定性的作用。

圖4. 傳統封閉抗體(A)、雙封閉抗體(B)封閉反應液擴增10000拷貝ASFV質粒擴增曲線圖

藍色：4℃放置10天；紅色：4℃放置0天（對照）

由圖4可以看出，雙封閉抗體比傳統封閉抗體更能保持反應液穩定，有效提升檢測試劑穩定性。雙封閉抗體封閉含引物探針全預混液4℃放置10天擴增曲線和Ct值無明顯變化。

圖5. 傳統封閉抗體(A)、雙封閉抗體(B)封閉反應液擴增10000拷貝ASFV質粒擴增曲線圖

藍色：37℃放置5天 ；綠色：37℃放置3天；黃色：37℃放置1天 ； 紅色：37℃放置0天（對照）

由圖5可以看出，雙封閉抗體比傳統封閉抗體更能保持反應液穩定，有效提升檢測試劑穩定性。雙封閉抗體封閉含引物探針全預混液37℃放置1、3、5天Ct值差小于0.2。

4 雙封閉抗體幫助解決基線上漂問題

某些引物配合特定buffer和儀器時，會出現基線上漂的情況。翌圣生物嘗試多種方法改善基線問題，發現雙封閉抗體更有利于基線平穩。