Benzonase?核酸內切酶——生物制藥生產中去除DNA的明智選擇，其價值已在過去的30多年里予以了證明。使用Benzonase?核酸內切酶的生產遵循GMP (ICH Q7)，從而提供了高質可靠的產品，以此平衡工藝的高效性和法規的要求。所有Benzonase?核酸內切酶產品具有相同的核酸序列（經LC-MS/MS質譜分析證實）、穩健性和活性。
作為一種沒有堿基偏好性的核酸內切酶，它們可以將DNA和RNA降解為3到5個堿基對(<6 kDa)的小片段，是監管機構要求的病毒載體和疫苗生產中去除核酸的理想工具。使用Benzonase?核酸內切酶可進一步增加病毒純化的收率，保護下游層析和過濾裝置不受污染，并且降低料液粘度。
為什么要優化Benzonase?核酸內切酶在生產工藝中的使用？
Benzonase?核酸內切酶是一款高質量產品，可為工藝帶來巨大價值。關鍵在于要以較經濟的方式使用它。由于Benzonase?核酸內切酶活性在很大程度上受到其所應用基質環境的影響，故其應用優化應當是工藝開發中必不可少的關鍵步驟。
在本方案中，我們將提供如何規劃和建立Benzonase?核酸內切酶實驗設計（DoE）優化實驗的指引。請注意，雖然在本方案中并未涉及Benzonase?核酸內切酶使用點（如在生物反應器中、細胞裂解后或澄清后操作）的優化，但就整體優化而言，則也應予以考慮。
優化流程
1、DoE介紹
實驗設計(DoE)是指利用統計學規劃、實施和分析多個因子對一個或一組參數的影響。DoE是一種強大的工具，可用于各種實驗情況，如優化酶的反應條件。為Benzonase?核酸內切酶的應用建立DoE，有助于找到最佳操作條件，達到工藝中所需的DNA清除率。
2、DoE設計
為了建立符合DoE概念的實驗系列，建議首先定義常數因子、具有中心點起始條件的輸入變量和輸出參數。
① 定義常數因子
?需已知樣品材料的平均DNA載量，用于計算所需酶量；
?由于病毒生產上游工藝的材料成分復雜，應用也各不相同，但Benzonase?核酸內切酶的優化目標是一致的。因此，可將其視為常數因子，以及由培養環境產生的pH值和鹽濃度也可視為常數因子。有關不同化學品對Benzonase?核酸內切酶性能的影響概述，請參考我們的產品手冊；
?由于Mg2+濃度是Benzonase?核酸內切酶發揮作用的最關鍵參數，因此應始終保持2mM的常量；
?培養容器和混合工藝過程應始終保持不變。
② 定義輸入變量
平衡Benzonase?核酸內切酶的作用效果取決于：
?Benzonase?濃度
?孵育時間
?孵育溫度
③ 定義輸出
由于Benzonase?核酸內切酶應用的目標是DNA消化，因此關鍵輸出為：
?DNA含量>100 bp片段
?產品完整性
3、已定義變量的中心點起始條件
建議設置以下起始點：
?孵育時間設置為2個小時
?孵育溫度設置為室溫，如21°C
Benzonase?核酸內切酶在標準測定條件下的理論濃度，根據下列公式，基于各樣品材料的DNA含量得出：
Benzonase?核酸內切酶用量應當基于隨產品提供的COA給定的實際活性（單位為U/μL）而定。
4、DoE實驗方案
下表建議Benzonase?核酸內切酶優化實驗設置的第一種方法。這種方法選擇三種溫度條件，分別為37°C、室溫和4°C，同時選擇1、2、6個小時的三種典型培養時間。結合三種Benzonase?核酸內切酶濃度，是理論濃度的x倍。
▲表一：建議實驗設計
5、檢測Benzonase?核酸內切酶效力
基于Benzonase?核酸內切酶的DNA消化應當使用宿主細胞DNA的100- 200堿基對片段的特定qPCR方法進行監測。完整的DNA經過Benzonase?核酸內切酶消化后降解成3到5個堿基對的片段，限制熒光DNA嵌入染料測定的效用，后者可檢測小至4個堿基對的DNA片段。建議選擇合適的對照實驗來確定消化工藝過程，從而確保穩健的結果。
DoE結果和后續步驟說明：
上表中建議的實驗設計是根據影響DNA/RNA消化的主要參數提出的建議。可根據您當前的資源，減少試驗次數或者增加更多的條件。一旦執行設計，建議首先證實生成數據是否與最初實驗假設相一致。然后充分分析和解釋結果。這可能需要進一步的試驗或基于縮窄圍繞已確定最優值的參數值范圍再進行DoE。此外，應考慮對生產工藝過程中的使用點（如在生物反應器中、細胞裂解后或澄清后）進行優化，以實現Benzonase?核酸內切酶最具經濟性的表現。
適用于GMP生產的Benzonase?：
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