題目：LncBRM initiates YAP1 signalling activation to drive self-renewal of liver cancer stem
cells
期刊：Nature Communications
影響因子：12.124
主要技術：RNA pull down、RIP、RNA-FISH、CRISPR/Cas9
研究背景
肝癌干細胞（干細胞）可能導致高復發率和肝細胞癌（HCC）的異質性。然而，肝干細胞生物學大部分仍然不明確。通過轉錄組的芯片數據分析，發現稱為lncBRM的長鏈非編碼RNA(lncRNA)在肝癌干細胞和HCC腫瘤中是高度表達的。LncBRM是肝癌干細胞自我更新維持和腫瘤發生所必需的。在肝癌干細胞中，lncBRM與BRM聯合啟動BRG1 / BRM轉換，BRG1嵌入BAF復合體觸發YAP1信號的激活。 此外，lncBRM與YAP1信號轉導目標的表達水平與HCC患者的腫瘤分期呈正相關。 因此，lncBRM和YAP1信號有望作為肝癌診斷和潛在藥物靶點的生物標志物。
研究思路
研究內容及結果
1. 作者首先通過成球實驗、Northern、RT-qPCR、RNA-FISH、核質分離等檢測手段，檢測了LncBRM在肝癌腫瘤組織和Huh7中高表達及細胞中的定位。
2. 接著在體外實驗和體內實驗中，沉默及過表達LncBRM，然后利用成球實驗、Northern Blot 和裸鼠成瘤等一系列實驗證明了LncBRM與細胞自我更新存在正調控。
3. 接著作者研究了lncBRM與蛋白BRM的互作。通過RNA pull down、RIP及EMSA證明LncBRM可以與BRM蛋白結合，而通過FISH檢測直觀地看到了LncBRM與BRM蛋白在細胞內的重疊分布。
作者接著進一步通過IP（Co-IP）及WB等檢測手段發現LncBRM與BRM結合將促使BRM/BRG1轉換；而一系列不同濃度shLncBRM的處理，進一步證明LncBRM與BRM聯合啟動BRG1/BRM交換。
4. 作者接著運用CRISPR/Cas9技術構建BRM KO株和BRG1 KO株，RT-qPCR檢測多個基因水平的變化情況，其中YAP1差異最為明顯；進而結合WB蛋白水平檢測，發現BRG1影響YAP1蛋白的表達。最后通過ChIP、雙熒光素酶、EMSA等手段確定BRG1是影響YAP1表達的關鍵因素。
5. 作者先通過Anti-KLF4 免疫共沉淀實驗確認KLF4可以與BRG1結合，再通過ChIP、EMSA證明KLF4又可以與YAP1啟動子結合。而CRISPR/Cas9技術基因敲除KLF4及突變YAP1啟動子后，再綜合進行ChIP、RT-qPCR和WB驗證，證明KLF4是直接影響YAP1蛋白表達。
6. 作者進一步通過成球實驗和裸鼠成瘤實驗再次確認YAP1是肝癌干細胞自我更新和腫瘤增殖所必須的。
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7. 臨床數據分析和標本檢測進一步驗證表明lncBRM與YAP1靶標的表達水平與HCC患者的腫瘤嚴重程度和預后呈正相關。
解析文獻
Pingping Zhu,Yanying Wang,et al. LncBRM initiates YAP1 signalling activation to drive self-renewal of liver cancer stem cells.Nature Communications.2016; DOI: 10.1038/ncomms13608
參考文獻
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