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B-27無血清添加劑（B-27 supplement,serum free）神經干細胞培養手冊

概述

神經干細胞(neural stem cell)是指存在于神經系統中，具有分化為神經神經元、星形膠質細胞和少突膠質細胞的潛能，從而能夠產生大量腦細胞組織，并能進行自我更新，并足以提供大量腦組織細胞的細胞群。

在神經干細胞培養中B-27與N-2添加劑的使用十分廣泛，B-27是一種最常被引用的神經細胞培養添加劑，是一種優化的無血清添加劑，用于支持胚胎、出生后和成年海馬神經元和其他中樞神經系統（CNS）神經元的生長和活性維持。

圖1. 神經干細胞的發展歷程

神經系統疾病及治療機理

神經系統疾病是指發生于中樞神經系統或周圍神經系統的以感覺、意識、運動等障礙為主要表現的疾病。包括帕金森病、阿爾茨海默病、卒中、肌萎縮性側索硬化癥（漸凍癥）、多發性硬化癥、亨廷頓病、小腦萎縮、脊髓損傷、外傷性腦損傷等。

神經干細胞的治療機理是：（i）患病部位組織損傷后釋放各種趨化因子，可以吸引神經干細胞聚集到損傷部位，并在局部微環境的作用下分化為不同種類的細胞，修復及補充損傷的神經細胞。由于缺血、缺氧導致的血管內皮細胞、膠質細胞的損傷，使局部通透性增加，另外在多種黏附分子的作用下，神經干細胞可以透過血腦屏障，高濃度的聚集在損傷部位；（ii）神經干細胞可以分泌多種神經營養因子，促進損傷細胞的修復；（iii）神經干細胞可以增強神經突觸之間的聯系，建立新的神經環路。

B-27在神經干細胞培養中的作用

1、優化產前和胚胎神經元的活性和長期存活率；

2、保證神經來源的腫瘤細胞系的活性；

3、擴增來自小鼠胚胎紋狀體和中腦的EGF響應性的前體細胞。

神經干細胞培養實驗步驟

1. 完全培養基制備

【注】原代海馬神經元培養，神經元完全培養基需要額外補充25 μM的L-谷氨酸，在培養的第4天以后的換液中應不再添加L-谷氨酸。配置好的完全培養基，可于2-8℃的避光保存一周。

2. 細胞培養步驟

下列步驟已在大鼠胎兒原代海馬和皮層神經元，以及神經母細胞瘤細胞系中測試。

1) 用無菌的冷的0.05 mg/mL多聚賴氨酸水溶液包被培養表面(玻璃或細胞培養級塑料)，每平方厘米表面使用0.15 mL，在室溫下保溫1 h。

2) 去除多聚賴氨酸溶液，并用無菌蒸餾水沖洗兩次(須徹底清洗，因為多聚賴氨酸對細胞有毒性)。在超凈工作臺中打開培養板的蓋子通風，直到每個孔都完全干燥。培養板干燥后可以立即使用或在4°C最多保存2周。

3) 根據標準實驗室程序或隨細胞提供的說明書分離原代的大鼠神經元或解凍凍存的原代大鼠神經元。

4) 在預熱的(37°C)神經元完全培養基中（如前所述的方法制備)接種細胞，建議的細胞密度為160個細胞/mm2，或必要時使用自行優化的細胞密度。

【注】對于海馬神經元，培養基中須添加25 μM L-谷氨酸，參見“完全培養基的制備”。

5) 在36°C至38°C，含5%二氧化碳的潮濕環境中培養（使用自然空氣也是可接受的，但推薦含9%氧氣和5%二氧化碳的氣體環境）。

6) 培養4-24 h后，更換一半體積的新鮮培養基，繼續在培養箱中培養。

7) 對海馬神經元以外的細胞：在接種4天后，更換一半體積的新鮮的完全培養基，之后每三天重復一次。對海馬神經元：接種三天后，用不含L-谷氨酸的新鮮培養基更換一半體積的培養基。之后每三天重復一次。

【注】在完全培養基中添加25 μM 2-巰基乙醇，可改善海馬神經元的長期存活率。

3. 分離原代大鼠胚胎神經元

下列程序推薦用于培養受精18天的大鼠胚胎海馬神經元和大腦皮層神經元。

1) 從受精18天的大鼠胚胎中分離大腦皮層和雙側海馬

2) 在預置了Hibernate-E完全培養基的錐形管中收集所有的組織。放置，直到所有的組織都已解體。

3) 使組織沉積在管的底部，然后小心地去除上清液，只留下剛好可覆蓋組織的最少量的培養基。

4) 在不含鈣離子的Hibernate-E培養基中，使用2 mg/mL過濾滅菌的木瓜蛋白酶溶液，在30°C酶解組織大約30 min，其間每5 min輕搖錐形管以幫助降解。每對海馬組織使用2 mL酶溶液。

5) 加入兩倍體積的Hibernate-E完全培養基以恢復二價陽離子的濃度，停止酶解。

6) 使未解離的組織沉降至管底（約2 min），然后把上清液轉移到15 mL離心管中，以150×g離心5 min。

7) 在1 mL神經元完全培養基中重懸沉淀物，取一小份(例如10 μL)進行細胞計數。后續的操作按照“復蘇和培養凍存的神經元”的第8-10步驟進行。

4. 復蘇和培養凍存的神經元

原代神經元細胞將會貼附在裸露的塑料或玻璃表面，建議事先用神經元完全培養基沖洗所有的塑料和玻璃器皿的內表面，以獲得最高的回收率和產量。由于細胞從凍存狀態復蘇時極其脆弱，請在整個操作過程中不要震蕩或離心細胞。我們建議每次只解凍一管細胞。務必減少從液氮中轉移凍存管到37°C水浴中的操作時間。細胞從液氮罐到水浴的運輸過程中，可在冰桶中放少量液氮，將細胞置于這個冰桶中來進行。

1) 在解凍細胞之前，用神經元完全培養基沖洗無菌的15 mL錐形管，然后在超凈工作臺中通風晾干。

2) 從液氮中取出凍存管時可稍微擰松管帽以釋放壓力，然后再擰緊。

3) 在37°C水浴中輕柔攪拌凍存管以快速解凍細胞（＜2 min）。當觀察到凍存管中只有很少量的冰晶存在時（觸摸凍存管仍然感覺是冷的）從水浴中取出。

4) 在超凈工作臺中用70%的異丙醇消毒凍存管。在工作臺臺面上輕敲凍存管以使管內液體沉降到管底。

5) 使用事先用神經元完全培養基沖洗并干燥過的1 mL吸頭極其輕柔地將細胞轉移到事先沖洗并干燥的15 mL錐形管中。

6) 用1 mL預熱的神經元完全培養基沖洗沖洗凍存管，以每秒一滴的速度極其緩慢地加入到15 mL錐形管中的細胞里。每加一滴都輕柔地轉動錐形管一次。不要一次即把全部培養基加到錐形管中。

7) 慢慢地逐滴加入另外2 mL預熱的完全培養基，使管內的液體體積為4 mL。用1 mL吸頭輕柔地混合液體，注意不要造成任何氣泡。

8) 用一個事先沖洗干燥過的吸頭吸取10μL細胞懸液加入到含有10μL 0.4%臺盼藍的微量離心管中，輕敲管壁以混勻溶液。使用手動的細胞計數方法測定活細胞密度。解凍的細胞的活率應超過50%。

9) 在已經事先用多聚賴氨酸包被（參見“細胞培養步驟”）的48孔板中每孔中接種大約1×105個細胞或按所需的細胞密度接種。加入預熱的神經元完全培養基將細胞懸液稀釋到每孔500μL。

10) 按照“細胞培養步驟”中的5-6步驟進行神經元的培養。在36°C至38°C，含5%二氧化碳的潮濕環境中培養（使用自然空氣也是可接受的，但推薦含9%氧氣和5%二氧化碳的氣體環境）。

常見問題

名詞小貼士：

神經（Nerve），是由聚集成束的神經纖維所構成。 而神經纖維本身是由多個神經元細胞構成，其神經元的構造為軸突外并被神經膠質細胞所形成的髓鞘包覆。 如此神經能將訊息從動物身體一處傳遞到另外一處，使動物能協調指揮動作與進行各種工作。

神經元（neuron），又名神經原或神經細胞，是神經系統的結構與功能單位之一。人腦中，神經細胞約有860億個。

神經干細胞（NSCs），是自我更新的多能細胞，可分化為神經系統的主要表型。這些細胞類型包括神經元，星形膠質細胞和少突膠質細胞。

神經祖細胞（NPC），是干細胞分裂的后代，其通常在體內經歷有限數量的復制循環。大腦中有許多“專業的”細胞，比如神經細胞，少突膠質細胞和星形膠質細胞。神經細胞傳遞和接受信息。少突膠質細胞包裹著神經細胞，為神經細胞更快地傳遞信息提供幫助。星形膠質細胞(星形細胞)通過提供營養和從身體的其他部位調節進入大腦來支持神經系統。

產品優勢:

1、高效培養，質量優良；

2、質控嚴格，嚴格無菌、無內毒素；

3、批次穩定，批間差異小；

4、貨期迅速，現貨供應。

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