在閱讀文獻和進行實驗的過程中，但凡涉及到分子表達的調控，我們總免不了聽到一個技術那便是Cre-loxP技術，那么Cre-loxP到底是一個什么樣的技術呢？跟著小編一起來了解一下吧。
Cre-loxP的基本原理
Cre-loxP重組是一種特定位點的重組酶技術，可以在DNA的特定位點上執行刪除、插入、易位以及倒位。該系統可以針對特定的細胞類型或者采用特定的外部刺激，對細胞中DNA進行改造，在真核和原核系統中都適用。
Cre（Cyclization Recombination Enzyme）：是一種重組酶，最早來源于P1噬菌體，屬于λInt 酶超基因家族。Cre重組酶基因編碼區序列全長1029bp，編碼38KDa蛋白質,由343個氨基酸組成。Cre重組酶可以識別特異性的DNA序列稱之為loxP的序列，可以對兩個loxP位點進行催化重組。
loxP位點：是位于P1噬菌體上由34個堿基組成的回文序列，是由13bp的反向重復序列和一個非對稱的8bp間隔序列組成。
圖1.Cre酶和loxP位點
Cre-loxP所介導的三種遺傳物質重排的方式
當細胞基因組存在兩個loxP位點的時候，一旦存在Cre酶會誘導loxP位點之間的序列發生重組。loxP位點的方向和位置決定了遺傳物質將會以以下的幾種方式進行重新排列：
1. 翻轉：當兩個loxP位點位于同一個染色體上并且方向相反時，兩個loxP位點的序列將會在Cre酶的作用下發生序列翻轉；
2. 缺失：當兩個loxP位點在同一染色體上且方向相同時，兩個loxP位點之間的序列將會在Cre酶的作用下被切除發生缺失；
3. 易位：兩個loxP位點位于不同染色體上并且方向相同時，將會在Cre酶的作用下則會導致DNA鏈的交換或染色體易位。
圖2. 遺傳物質重排的三種方式
兩種策略實現Cre依賴的基因表達
在序列只存在一對loxP位點的時候，在Cre酶的作用下，遺傳物質重排的方式是可逆的，如何使他們達到穩定？我們可以通過下面的兩種策略實現Cre依賴的基因表達。
1. DIO序列策略
DIO序列策略的關鍵在于引入兩對不同的lox位點：LoxP和Lox2272。在Cre酶的作用下，不論是識別LoxP還是Lox2272位點，第一步都可以實現目標基因的反轉。反轉會使兩個loxP位點或者Lox2272位點變成同向。第二步在Cre酶的作用下，剪切刪除一個LoxP位點和一個Lox2272位點，進而實現基因的穩定表達。
圖3.DIO序列策略原理
2. LSL序列策略
LSL序列策略是將LoxP和轉錄中止盒插入啟動子和目的基因中間，構成轉錄“終止盒”（Lox-stop-Lox），這個“終止盒”能夠終止基因的轉錄。在沒有Cre酶的作用下，轉錄終止盒下游靶基因完全不表達。但是如果細胞中有Cre酶，終止盒會被Cre酶切除，從而實現組織特異性的基因過表達。
圖4.LSL序列策略原理
Cre-loxP系統的優點
1. 高效性：不會受靶基因大小和位置的影響，有研究表明兩個loxP之間的距離在1.5-3.5kb之間時，敲除效率可以達到99%。
2. 時空特異性：除了實現目的基因在特定組織（利用組織特異性啟動子+Cre）中的改造之外，還可以實現目的基因在特定時間的表達，具體的方法就是更加精準的誘導型Cre-loxP系統，這一部分將會在下期接著和大家做進一步說明；
3. 應用范圍廣：在不同的靶器官和各種生理條件下都適用。
Cre-loxP系統的應用-基因敲除鼠的繁育
基于Cre-loxP系統的種種優點，研究人員們將它應用到科學研究中實現體內某特定基因在特定條件下的敲除，原理如下圖所示。首先需要兩只轉基因小鼠。第一只轉基因小鼠的獲得是在體外構建一個目的基因兩端含有loxP位點的基因序列，將這段序列轉入胚胎干細胞內。通過同源重組技術替代野生型的細胞的基因序列。通過胚胎干細胞技術處理的胚胎干細胞被重新植入到假孕小鼠的子宮內，使其重新發育成為一個完整的胚胎，最終得到特定位點含有loxP的轉基因小鼠。第二只轉基因小鼠一般采用卵母細胞注射或者胚胎干細胞技術獲得，在這只小鼠中，Cre重組酶被置于某特定基因啟動子的調控之下，可以使其在某特定的條件下表達。最后，讓這兩只小鼠進行交配，產生的同時含有上述兩種基因型的子代小鼠就會在某一特定類型的細胞中缺失某一特定的基因。想要或者KO的小鼠，需要在Cre小鼠和Floxp小鼠雜交得到后代F1的基礎上和野生型小鼠進一步進行雜交。
圖5.基因敲除鼠的繁育過程
轉基因動物的缺點
1. 時間周期長：轉基因小鼠很難獲得，雖然現在已經有很多的Cre和loxP轉基因動物，但是因為時間和成本的原因，轉基因動物本身就很難獲得。其次獲得轉基因動物之后，需要將轉基因動物進行交配，至少兩代才能獲得基因敲除的小鼠，交配一代至少需要2個月的時間，所以至少需要半年才能拿到基因敲除的小鼠。
2. 組織特異性不高：轉基因小鼠所依賴的基因敲除只能依賴于啟動子的調控，而有些啟動子并不能實現組織特異性的表達，這樣就會使得組織特異性不高影響實驗準確性。
所以說想要更加省時間、省費用的人為操控基因的表達和過表達和敲定，我們在轉基因動物的基礎上需要利用Cre-loxP技術去發展出更加高效的科研工具。工具病毒應運而生，關于科研病毒的使用將在下一期進行講解，希望大家持續關注。
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