基因功能缺失與獲得是研究其功能的主流操作方法，前者主要通過干擾（RNAi）或敲除（CRISPR/cas系統(tǒng)）的方式實現(xiàn)。兩大下調(diào)技術(shù)已經(jīng)很成熟，并且運用廣泛，但是針對諸多l(xiāng)ncRNA的表達(dá)抑制，當(dāng)前技術(shù)尚有欠缺。
長鏈非編碼RNA（lncRNA）是當(dāng)前研究熱門的分子之一，反義寡核苷酸ASO可以實現(xiàn)lncRNA在細(xì)胞水平的敲低，但化學(xué)合成的ASO，并不能實現(xiàn)長期穩(wěn)定的下調(diào)，而通過質(zhì)粒或者病毒遞送的RNAi只能實現(xiàn)部分lncRNA的敲低（主要因為其二級結(jié)構(gòu)復(fù)雜，不編碼，部分定位細(xì)胞核的特征）。
CRISPR/Cas9 系統(tǒng)為分子生物學(xué)的所有領(lǐng)域提供了革命性的基因組編輯工具。在長鏈非編碼 RNA (lncRNA) 研究中，Cas9 核酸酶可以刪除 lncRNA 基因或?qū)?RNA 不穩(wěn)定元件引入其基因座, 許多 lncRNA 源自雙向啟動子或與啟動子或有義或反義基因體重疊。但在全基因組分析中，Goyal等人發(fā)現(xiàn) 15929 個 lncRNA 基因座中只有 38% 可以安全地進(jìn)行 CRISPR 應(yīng)用，而幾乎三分之二的 lncRNA 在基因座有鄰近或重疊基因，這就限制了其在細(xì)胞水平的穩(wěn)定敲除< 學(xué)會lncRNA沉默的方法,從此lncRNA研究不發(fā)愁! >。
新型的基因表達(dá)抑制技術(shù)CRISPRi ，通過對Cas9蛋白的RuvC1和 HNH兩個核酸酶活性區(qū)域突變，只保留由gRNA引導(dǎo)進(jìn)入基因組的能力（稱為dCas9-dead Cas9），并與 ZNF10 的 KRAB（Krüppel-associated box）結(jié)構(gòu)域融合，dCas9 當(dāng)被募集到基因啟動子附近時會干擾轉(zhuǎn)錄起始或延伸，從而導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄減少，形成了新型的基因下調(diào)技術(shù)。
Cho等人在cell上通過CRISPRi干預(yù)PVT1啟動子的轉(zhuǎn)錄，并通過siRNA、ASO下調(diào)PVT1，證明了PVT1啟動子影響MYC表達(dá)和細(xì)胞生長的，而非PVT1這個lncRNA 的功能，這就為研究啟動子的功能提供一個有力的工具。LncRNA功能之一為其自身無功能，但其轉(zhuǎn)錄時，會影響其他基因的轉(zhuǎn)錄，稱為順式調(diào)節(jié)，CRISPRi不但可以實現(xiàn)啟動子的轉(zhuǎn)錄抑制，同時也下調(diào)了lncRNA，可謂一石二鳥。
Liu等人使用CRISPRi文庫來篩選人類膠質(zhì)母細(xì)胞瘤 (GBM) 細(xì)胞中的 5689 個 lncRNA 基因座，得到33個使細(xì)胞對輻射敏感的lncRNA：
最終確定了lncGRS-1為神經(jīng)膠質(zhì)瘤特異性治療靶點，并建立了一種通用方法來快速確定大量非編碼基因組中的新治療靶點，以增強(qiáng)放射治療：
已知 Pcsk9 蛋白的丟失會降低 LDL 膽固醇的血清水平。Matthew等人運用CRISPRi技術(shù)，將dCas9-KRAB系統(tǒng)插入小鼠ROSA26基因座，以及設(shè)計Pcsk9的靶向 gRNA在肝臟中抑制Pcsk9，成功抑制了編碼基因Pcsk9的表達(dá)，并建立了低膽固醇水平的小鼠：
Pcsk9-小鼠模型的建立，說明CRISPRi在動物實驗的有效性，無論是編碼基因還是lncRNA，CRISPRi均能實現(xiàn)表達(dá)抑制。
通過谷歌學(xué)術(shù)查詢，CRISPRi的文獻(xiàn)多集中于近兩三年。傳統(tǒng)的RNAi雖然使用、設(shè)計較為方便，但一般要求基因表達(dá)水平較高且定位胞漿；CRISPR/Cas9不要求基因高表達(dá)，但針對編碼基因的KO形成雜亂的移碼突變，很多科研者往往要構(gòu)建單克隆細(xì)胞系，無疑加大了建系難度；
而CRISPRi，由于在基因轉(zhuǎn)錄時抑制其表達(dá)，所以既不要求基因是高表達(dá)的，也不會形成雜亂的移碼突變，在技術(shù)上尤其先進(jìn)性，但也有技術(shù)缺陷，其一是要求抑制的基因在基因座不含有鄰近基因，不然無法實現(xiàn)特異性；其二是CRISPR有潛在的脫靶性，當(dāng)然，該缺陷前兩種技術(shù)也有，所以在實驗設(shè)計時，需設(shè)計雙靶點同時實驗，或者設(shè)計回復(fù)實驗。
CRISPRi最大的應(yīng)用價值還是在lncRNA上，lncRNA較難敲低及敲除，在轉(zhuǎn)錄之初就抑制其表達(dá)，無需關(guān)心lncRNA的表達(dá)水平、二級結(jié)構(gòu)、細(xì)胞定位等情況，只需在其基因座上無鄰近基因，即可進(jìn)行設(shè)計并抑制。且可以運用CRISPRi文庫針對細(xì)胞所有的lncRNA進(jìn)行高通量篩選，尋找靶標(biāo)，助力功能性lncRNA的發(fā)現(xiàn)！
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