親和層析的特異、靈敏性及快速高效等特點，使其在生物制藥、生物化學、分子生物學、臨床診斷等多個領域都有重要應用。然而市售成熟的相關介質并非完全能夠匹配所研項目需求，因此自制親和填料成為理想工具之一。

預活化層析填料可以偶聯一個特定的配基，制備成一個可以純化一種或者幾種目標分子的親和填料。例如，可以使用抗體、抗原、酶、受體、小的核酸或者多肽作為配基，純化能與它們結合的相應的配體。

相關填料介紹

偶聯方案

• 偶聯溶液A：1mM HCl 

• 偶聯溶液B：0.1M NaHCO3、0.5M NaCl，pH 8.3

? 填料換液處理

取已知體積介質于砂芯漏斗中，用預冷的偶聯溶液 A（0~4℃）洗滌，至少洗 30min，1ml 介質用約 20ml 的偶聯溶液 A 洗滌；注意：NHS 對應配基在 pH 較高時會迅速水解。

? 配基換液及偶聯反應

配基用偶聯溶液 B 溶解，或用 Bestdex G-25 層析柱置換于偶聯溶液 B 中（配基偶聯濃度 5~10mg/ml 填料）。將洗好的介質用偶聯溶液 A 稀釋（1ml 介質約 0.5ml 偶聯溶液 A），并與配基溶液等體積混合，室溫混勻 4h 或 4℃ 攪拌過夜（不能使用磁力攪拌器）。

• 說明：在室溫下，偶聯過程通常非?？?，因此，通過優化偶聯時間來維持配基的生物活性是很重要的 (先準備配基再進行填料的換液處理)。

? 封閉和清洗

• 封閉：抽去偶聯上清并加入封閉液（0.1M Tris-HCl，pH 8.5），室溫封閉 2~4h；

• 清洗： 0.1M Tris-HCl+0.5M NaCl， pH 8~9 與 0.1M 醋酸鹽緩沖液+0.5M NaCl，pH 3~4 交替洗滌 3~6 次，每次用 3 倍凝膠體積的液體洗滌；

• 用 PBS 清洗后使用或保存于 20% 乙醇中（配基必須在 20% 乙醇中穩定）。

層析案例分享

? CNBr-activated Bestarose 4B

抗原作為配基實現多克隆抗血清的高通量純化該案例是將特定的抗原偶聯到預活化的填料上，制備成專用的親和層析柱，從多克隆抗血清中純化特異性的抗體。

? NHS-activated Bestarose 4FF 偶聯多肽捕獲重組蛋白

注意事項

一般情況下，當配基分子量＜5KDa時使用間隔臂，而對于大分子，間隔臂非必須。例如，NHS 預活化填料的反應位點與填料基架之間有 10 個原子的間隔臂，而 CNBr 則沒有，對于小分子配基（＜5KDa），當配基和樣品結合的時候，由于 CNBr 沒有間隔臂，可能會由于空間位阻而影響結合，在這種情況下，建議使用 NHS 活化配基填料。對于大于 5KDa 的配基，二者差異不大。