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4D蛋白質(zhì)組學在傳統(tǒng)3D保留時間（retentiontime）、質(zhì)荷比（m/z）、離子強度（intensity）這三個維度分離基礎之上增加了第四維肽段的碰撞截面積（CCS）--離子淌度（mobility）的分離，重新定義了蛋白質(zhì)組學的分析標準。4D蛋白質(zhì)組學基于timsTOFPro上的PASEF技術，大幅度的提高質(zhì)譜掃描速度和檢測靈敏度，實現(xiàn)蛋白質(zhì)組學在鑒定深度、檢測周期、定量準確性等性能的革命性提升。
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實驗流程
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數(shù)據(jù)分析
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技術優(yōu)勢
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4D技術加持，更加適合微量樣本
克服標記定量蛋白質(zhì)組學技術在樣本數(shù)量上的限制，靈活方便
采用布魯克的timsTOFPro質(zhì)譜平臺，檢測速度提升近一倍
針對4D蛋白質(zhì)組學技術，金開瑞推出了4D Label-free、4D DIA和4D 磷酸化等4D翻譯后修飾組學技術服務，為廣大科研工作者提供高質(zhì)量和全程售后的4D技術服務。
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4D-DIA定量蛋白質(zhì)組學
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4D-DIA蛋白質(zhì)組學是基于timsTOFPro離子淌度平臺的新一代DIA技術，通過數(shù)據(jù)非依賴采集-同步累積連續(xù)碎裂（diaPASEF）掃描模式進行差異定量蛋白質(zhì)組學分析。將DIA技術與基于timsTOFPro上的diaPASEF技術相結合，具有高掃描速度和高靈敏度優(yōu)勢的同時，外加第四維離子淌度分離，使DIA數(shù)據(jù)在采集時不犧牲窗口循環(huán)速度的同時，降低譜圖復雜度和提高離子利用率，實現(xiàn)了蛋白質(zhì)組學在覆蓋深度、靈敏度、通量方面的全面性提升。
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技術原理
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蛋白質(zhì)組學技術可分為數(shù)據(jù)依賴型（Data-dependentacquisition，DDA）策略，和數(shù)據(jù)非依賴采集（Data-independentAcquisition，DIA）策略。
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1.DDA策略：在一級質(zhì)譜中在每個時間窗口采集強度較高的有限肽段離子進入二級質(zhì)譜進行碎裂分析；
2.DIA策略：將質(zhì)譜整個全掃描范圍分為若干個窗口，并循環(huán)地對每個窗口中的所有離子進行選擇、碎裂、檢測。
DIA技術可以無遺漏地獲得樣本中所有離子的全部碎片信息。因此，在定量上可以獲得更多定量信息，且基于MS2信號，定量準確度更高，重復性更好。
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實驗流程
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技術優(yōu)勢
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1.近乎100%的離子利用率，極大提升檢測靈敏度
在diaPASEF的掃描模式中，與離子淌度相關的CCS值和m/z之間有一定的相關性，因此四級桿可以利用這個特征逐步掃描來采集近乎100%的離子信號，極大提升檢測的靈敏度和深度；而在DDA和傳統(tǒng)的DIA模式中，這些信號只有一小部分可以被采集。
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2.顯著提升檢測深度
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4D-DIA技術可顯著提升蛋白質(zhì)組學檢測深度，該技術在200ngHeLa裂解液的120分鐘單針實驗中，可以鑒定超過7500種蛋白質(zhì)，并且三次實驗的共同定量了6974個蛋白，數(shù)據(jù)完整性高達96%；而相比之下，在傳統(tǒng)的DIA技術中，通常需要g級的樣品才能檢測約5000左右的蛋白。
3.全面提升定量完整性
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基于卓越的儀器性能和先進的采集方法，4D-DIA技術還可以進一步挑戰(zhàn)靈敏度的極限。從僅僅10ngHeLa裂解液的120分鐘單針實驗中，能夠鑒定到3323個蛋白，而相同實驗條件下的4D-DDA模式只能鑒定到2723個蛋白。而即便是在如此衡量的情況下，4D-DIA在蛋白質(zhì)定量上也能實現(xiàn)了85％的數(shù)據(jù)完整性。
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數(shù)據(jù)分析
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應用方向
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臨床微量樣本最佳檢測方式，如：外泌體、FFPE石蠟切片、活檢穿刺組織等
臨床大隊列樣本分析，如腫瘤、心血管等重大疾病精準分型
作物群體性狀等大規(guī)模樣本研究，如育種品系、脅迫干預等
臨床生物標志物發(fā)現(xiàn)：DIA接近MRM的定量能力，實現(xiàn)標志物篩選與初步驗證過程合二為一
生物樣本信息庫構建：DIA可實現(xiàn)生物信息的完整保存，為后續(xù)回溯分析提供保障。藥物應答、基因敲除/過表達的蛋白表達譜分析
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4D Label Free蛋白質(zhì)組學
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實驗流程
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技術優(yōu)勢
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4D在鑒定準度、鑒定深度、定量準確性、檢測周期上均有較大提升，樣本量要求上較大程度降低，具體性能參數(shù)如下：
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1.鑒定更精準
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4維分離，蛋白鑒定的精確度更高。尤其是生物樣本的蛋白質(zhì)組成復雜，存在大量的共洗脫現(xiàn)象，在很小的保留時間內(nèi)卻存在大量共洗脫肽，質(zhì)量差異（m/z）小。而離子淌度中對質(zhì)量差異小的肽段進行區(qū)分（離子遷移率不同），實現(xiàn)更精準的鑒定。
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2.鑒定數(shù)更多
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相同測試條件下，4DLabel free比傳統(tǒng)Labelfree技術檢測能力提高50%以上。例如90min，4Dlabel free蛋白組鑒定到hela蛋白5200個，鑒定數(shù)提高62.5%；11.5min，4Dlabel free蛋白組鑒定到血液蛋白超過500多個，蛋白鑒定數(shù)提高50%。
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3.定量更穩(wěn)定
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連續(xù)進樣96針，R2>0.95，CV<5%，定量范圍超過3個數(shù)量級。
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4.項目周期更短
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PASEF獨特的采集模式，實現(xiàn)超高掃描速度，實驗周期大幅縮減。
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5.樣本量要求更低
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4D蛋白組的上樣量降低到傳統(tǒng)方法降低1/10，只需200ng。原始樣本量降低到傳統(tǒng)方法的1/4。只需少量樣本，就能達到深度覆蓋。
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數(shù)據(jù)分析
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應用方向
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藥物應答、基因敲除/過表達的蛋白表達譜分析
植物、微生物生長發(fā)育與脅迫逆境生理研究
疾病生物標志物與藥物作用靶點高通量分析
蛋白作用機制與特殊功能蛋白質(zhì)篩選
各種物種的蛋白質(zhì)組草圖構建
臨床微量樣本最佳檢測方式，如：外泌體、FFPE石蠟切片、活檢穿刺組織等
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修飾蛋白組學實驗思路
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4D-修飾蛋白質(zhì)組學
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蛋白質(zhì)磷酸化修飾（Phosphorylation）是生物體內(nèi)最重要的共價修飾方式之一，是目前分布最多、也是最廣泛研究的修飾，其發(fā)生過程是在激酶（kinase）催化下，將ATP的磷酸根基團轉移到蛋白的氨基酸（Ser、Tyr、Thr）側鏈上。
蛋白質(zhì)乙酰化（acetylation）是指在乙酰基轉移酶的催化下把乙酰基團（如乙酰輔酶A等供體）共價結合到底物蛋白質(zhì)的賴氨酸殘基上的過程，主要發(fā)生在蛋白質(zhì)賴氨酸殘基的ε-NH2位，其分子質(zhì)量會相應增加42.01Da，質(zhì)譜能夠精確地測定分子量是否發(fā)生相應的質(zhì)量偏移，實現(xiàn)酰化修飾肽段及位點的分析。
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蛋白泛素化修飾（Ubiquitination）發(fā)生過程是通過一個三酶級聯(lián)(E1-E2-E3)反應，使得單或多個泛素分子連接到蛋白氨基酸（Lys）側鏈上，并常伴隨蛋白酶體降解，調(diào)控蛋白表達水平變化。發(fā)生泛素化修飾的賴氨酸共價連接泛素分子，即兩個甘氨酸K-ε-GG殘基，使分子量產(chǎn)生114.1Da的質(zhì)量偏移。利用質(zhì)譜可精確測定分子量是否發(fā)生114.1Da的質(zhì)量偏移，從而檢測泛素化修飾肽段及位點。
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4D-labelfree修飾組基于新一代timsTOFPro質(zhì)譜儀，通過數(shù)據(jù)依賴性采集-同步累積連續(xù)碎裂（ddaPASEF）掃描模式進行修飾化差異蛋白質(zhì)組學分析，利用了離子淌度分離，能根據(jù)分子的形狀、截面積屬性，可有效區(qū)分修飾同分異構多肽，極大提高修飾的鑒定深度，以更少上樣量、更快掃描速度，實現(xiàn)蛋白質(zhì)組學在覆蓋深度、靈敏度、通量方面的全面性提升。
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實驗流程
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數(shù)據(jù)分析
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應用方向
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4D-磷酸化修飾蛋白質(zhì)組學
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細胞通信、生長和增殖、細胞周期調(diào)控；
癌變的發(fā)生和轉移、神經(jīng)傳導；
血管和胚胎形成等藥理藥靶、基因敲除/過表達的修飾表達分析；
植物、微生物生長發(fā)育與脅迫逆境生理研究；
疾病藥物作用靶點高通量分析。
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4D-乙酰化修飾蛋白質(zhì)組學
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代謝調(diào)控：代謝疾病、代謝紊亂等；
藥理藥靶、基因敲除/過表達的修飾表達分析；
植物、微生物生長發(fā)育生理研究；
細胞自噬、細胞周期、衰老等信號通路；
蛋白作用機制與特殊功能蛋白質(zhì)篩選；
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4D-泛素化修飾蛋白質(zhì)組學
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藥理藥靶、基因敲除/過表達的修飾表達分析；
植物、微生物生長發(fā)育與脅迫逆境生理研究；
細胞自噬、細胞周期、衰老等信號通路；
疾病生物標志物與藥物作用靶點高通量分析；
神經(jīng)及退行性疾病、腫瘤發(fā)病機制等機制研究；
蛋白作用機制與特殊功能蛋白質(zhì)篩選。
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