編者按：肺癌類器官（LCO）可重現親代腫瘤的組織學和遺傳特征。利用集成超疏水性微孔陣列芯片（InSNAR-chip），數百個LCO最少能夠在一周內產生臨床意義的藥物應答。
今天，我們回顧了一項于2021年5月10日發表在《自然·通訊》的經典研究——《Lung cancer organoids analyzed on microwell arrays predict drug responses of patients within a week》，該研究為預測臨床上患者的特定藥物應答情況提供了一種技術上可行的方法。
一、研究背景
盡管藥物的可獲得性越來越高，但由于缺乏對治療結果的準確預測，無法及時為患者選擇合適的治療方案，肺癌仍是全球癌癥死亡的主要原因[1]，雖然DNA 測序開創了精準醫療的時代，但腫瘤的異質性可能會混淆這種基因-藥物聯系[2]。因此體外腫瘤模型在基因組學和病理學結果之間發揮著重要作用?；颊哐苌漠惙N移植物（PDX）常常被用于預測患者的藥物應答反應，但由于成功率低、周期時間長、成本高、成功率有限[3]。
后來，患者衍生的腫瘤類器官（PDO）成為精準醫學中一種可靠的體外腫瘤模型[4][5][6]。然而目前基于PDO的藥物測試仍然需要數月才能向患者提供結果，主要原因是使用傳統的細胞培養技術，需要長時間的體外擴增才能產生足夠數量的PDO[7]，而且目前還有某些類型的腫瘤尚未建立PDO的培養條件。
為了克服上述技術挑戰，本研究設想通過使用微加工陣列設備（通常用納升體積即可），來減少基于PDO的藥物測試反應體積。首先從患者樣本中獲取大量肺癌類器官(LCO），驗證其腫瘤器官形態、組織病理學、DNA CNV突變譜和基因表達與原始腫瘤一致，再開發一種集成的超疏水微孔陣列芯片（InSMAR-chip），用于高通量三維（3D）培養和分析[8][9]。LCO結合InSMAR芯片可為及時預測肺癌患者的特異性藥物反應提供一種有效的方法。
二、研究結果
1. 肺癌組織來源的LCO的構建
原文圖1 構建LCO的過程圖
本研究使用機械法處理了103例手術切除的肺腫瘤樣本，包括71例腺癌（ACs），23例鱗狀細胞癌（SCCr），4例小細胞肺癌（SCLCs）和5例其他亞型的肺癌。利用InSNAR芯片對一種藥物進行敏感性測試，對于類器官數量的最小需要量約為100個，而在本研究中，71例AC中有55例，23例SCC中有18例、4例SCLC中有4例和5例其他肺癌樣本中的4例構建后獲得了大于100個類器官，因此本研究中的樣本處理成功率為79%。在這103例樣本中，有42例腫瘤和相應的正常組織一起處理，每例正常組織大約只產生了15個 正常肺類器官（NLS），比每例肺癌組織產生的LCO數量少200倍左右。
為進一步確認腫瘤類器官主要由腫瘤細胞組成，本研究使用了一種LCO特制培養基，其中不含NLS培養所需的生長因子，比如FGF7、FGF10、R-spondin 1和Noggin，結果表明作者的樣品處理和培養方法可以產生適合后續藥物敏感性測試的LCO。
2. LCO的特征
原文圖2 肺癌組織及其衍生類器官的HE和免疫組化染色圖像
作者對肺癌組織和相應的LCO進行了全基因組測序分析，確定了12組肺癌組織及其對應的腫瘤類器官的基因組特征，發現了LCO保留了原有組織DNA拷貝數的增益和損失，但由于癌細胞的富集，LCO比原始肺癌組織表現出更清晰的信號。作者還發現，在匹配的樣本當中，突變負荷和突變類型大多是保守的，而不同患者樣本在突變總數和個體特征的相對貢獻方面則表現出很高的差異。然后作者將LCO的基因表達譜與匹配的癌組織和正常組織進行比較，發現在LCO中，與細胞粘附分子和免疫反應相關的基因富集，這與類器官培養中缺乏腫瘤微環境相一致。
作者用機械處理方法長期培養了16例AC和4例SCC樣本的LCO，培養時長至少超過1個月，他們發現這些LCO的增殖率和擴增能力具有很大的差異?？傮w來說，機械加工法產生的LCO保留了原始腫瘤的組織學和遺傳特征，并可以在體外長期培養和傳代后保持穩定，說明原代LCO確實具有腫瘤類器官的主要特征。
3. InSMAR-chip用于藥物敏感性測試
原文圖3 集成超疏水微孔陣列芯片（InSMAR-chip）的表征
作者開發了一款InSMAR-chip，是一種集成超疏水微孔陣列芯片，可用于培養LCOs并在納升尺度上測量LCOs對藥物的反應，發現了芯片上培養的LCOs的生長速度和活力與在傳統微孔板上培養的相似，更重要的是保持了親代腫瘤組織的三維結構。作者在InSMAR-chip上追蹤LCOs的生長，發現LCOs可在InSMAR-chip上持續增長至少3周。
原文圖4 InSNAR-芯片上基于類器官的1周藥物敏感性測試的驗證
接下來作者在InSMAR-chip上進行了6天的藥物敏感性測試，在InSMAR-chip和96孔板上進行細胞活力測試，研究表明芯片上測得的藥物-反應曲線與96孔板上的曲線完全重合，證明了芯片上細胞活力測量的可靠性。作者也測試了在InSMAR-chip上培養的LCO對靶向藥物和化療藥物的應答是否正常，發現了正如預期那樣，在LCO的培養基中加入吉西他濱，S期細胞的百分比從處理前的13.9%下降到暴露24小時后的0%，除了細胞周期中斷外，吉西他濱處理的細胞還顯示抗凋亡基因Bcl2的表達受到抑制，自噬相關基因Beclin-1和LC-3的表達提高。
原文圖5 基于LCO的1周藥敏試驗反應了肺癌對靶向藥物的應答情況
作者測試了常用抗肺癌藥物對來自21個患者樣本的類器官的影響，作者首先利用12個樣本證明了LCO對靶向治療的反應與原始腫瘤的基因突變有關，9個LCO來自未接受治療的患者，其中6個具有對酪氨酸激酶抑制劑敏感的EGFR激活突變，另外3個具有野生型EGFR。因此，本文作者在InSMAR-chip上培養LCO并用吉非替尼（EGFR的靶向藥）進行藥敏測試，結果顯示，有EGFR突變的LCO細胞活率顯著下降，而EGFR野生型的LCO則正常增殖，符合預期。研究人員還比較了攜帶EML4-ALK重排突變的LC130-O和另外兩個ALK陰性的LCOs （LC96-O和LC131-O）對另一種靶向藥物克唑替尼的反應。結果表明，LC130-O對Cri的敏感性高于其他兩種LCO。
這些結果表明，與基因突變相比，一周芯片上檢測更能反映腫瘤的獲得性耐藥。
4. 藥敏測試總結了患者對化療的反應
原文圖6 一周藥敏試驗代表腫瘤對化療的反應異質性
作者將InSMAR-chip上的LCO的藥敏結果與臨床上相應患者的反應進行比較，發現在吉西他濱+順鉑治療兩個療程后，在同側L2淋巴結中發現了一個新的轉移灶，表明原始腫瘤對這一治療方案具有耐藥性，而同一患者來源的LCO在InSMAR-chip上的藥敏測試結果也證明了該患者對這一治療方案的耐藥性?？偟膩碚f，作者在InSMAR-chip上總共對21個類器官進行了藥物敏感性測試，評估各個患者的反應，通過芯片分析、測試、給藥，一周藥物敏感性測試結果與臨床數據一致，這些結果證明了為期一周的芯片藥物敏感性試驗在預測患者治療反應方面具有很大潛力。
三、編者點評：
雖然患者衍生類器官（PDO）對抗癌治療的反應已經得到充分認識，但建立PDO時間長且效率低阻礙了藥物敏感性測試在臨床方面的實施，所以本文作者采用機械樣品處理方法，從手術切除和活檢的腫瘤組織中構建肺癌類器官（LCO），通過使用集成超疏水性微孔陣列芯片（InSMAR-chip），證明了數百個LCO可以在一周內產生具有臨床意義的藥物反應，結果表明，作者的一周藥物敏感性檢測與患者來源的異種移植物、腫瘤基因突變和臨床結果保持一致。LCO模型與微孔裝置的結合，加快了類器官用于個體化精準醫療的步伐。
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參考資料：
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[3]Hidalgo, M. et al. Patient-derived xenograft models: an emerging platform for translational cancer research.Cancer Discov.4, 998–1013 (2014).
[4]Tuveson, D. & Clevers, H. Cancer modeling meets human organoid technology.Science364, 952–955 (2019).
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[10]Cohen, M. H., Williams, G. A., Sridhara, R., Chen, G. & Pazdur, R. FDA drug approval summary: gefitinib (ZD1839) (Iressa) tablets.Oncologist8, 303–306 (2003).