1.?百螢Annexin V-iFluor 700標(biāo)記簡介及應(yīng)用
Annexin V是一種分子量為35-36kD的Ca2+依賴性磷脂結(jié)合蛋白，能與細胞凋亡過程中翻轉(zhuǎn)到膜外的磷脂酰絲氨酸（PS）高親和力特異性結(jié)合。在正常細胞中，磷脂酰絲氨酸（PS）只分布在細胞膜脂質(zhì)雙層的內(nèi)側(cè)，而在細胞凋亡早期，細胞膜中的磷脂酰絲氨酸（PS）由脂膜內(nèi)側(cè)翻向外側(cè)。用標(biāo)記了熒光素的Annexin V作為熒光探針，利用流式細胞儀或熒光顯微鏡可檢測細胞凋亡的發(fā)生。
Annexin V-iFluor 700標(biāo)記是美國AAT Bioquest研發(fā)的用于檢測細胞功能的探針，膜聯(lián)蛋白是鈣依賴性磷脂結(jié)合蛋白家族。 它們富含真核生物，屬于參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的普遍存在的細胞質(zhì)蛋白家族。 膜聯(lián)蛋白V的優(yōu)先結(jié)合配偶體是磷脂酰絲氨酸（PS），其通常保持在細胞膜的內(nèi)葉（細胞質(zhì)側(cè)）。 在細胞凋亡中，PS被轉(zhuǎn)移到質(zhì)膜的外部小葉。 磷脂酰絲氨酸在細胞表面上的出現(xiàn)是細胞凋亡的初始/中間階段的通用指示，并且可以在觀察到形態(tài)變化之前檢測到。 我們的膜聯(lián)蛋白V結(jié)合物是一組監(jiān)測細胞功能的工具，旨在通過測量磷脂酰絲氨酸的易位來監(jiān)測細胞凋亡。
膜聯(lián)蛋白V結(jié)合物在Ca2+存在下與凋亡細胞表面上的PS結(jié)合，它也可以通過壞死細胞膜或死細胞并與細胞內(nèi)部的PS結(jié)合。 因此，我們建議將細胞不可滲透的核染色與膜聯(lián)蛋白V結(jié)合物結(jié)合使用，以區(qū)分死細胞和凋亡細胞。?
2.?Annexin V-iFluor 700標(biāo)記參數(shù)
E x (nm) ???????690
E m (nm) ?????713
分 子 量 ?????～36000
溶 ???劑 ?????Water
存儲條件? ? ?在零下15度以下保存，避免光照
3.?適用儀器
（1）流式細胞儀
E x:640nm
E m:730/45nm
通道:Alexa Flour-700通道
（2）熒光顯微鏡
???推薦孔板：黑色透明底板
4.?數(shù)據(jù)分析
下圖是使用流式細胞儀檢測膜聯(lián)蛋白V-mFluor Violet 450與磷脂酰絲氨酸在Jurkat細胞凋亡中的結(jié)合活性的實例。 在活的非凋亡細胞中，膜聯(lián)蛋白V-mFluor Violet 450檢測非誘導(dǎo)細胞中的先天性細胞凋亡，其通常為所有細胞的2-6％。 在凋亡細胞中，膜聯(lián)蛋白V-mFluor Violet 450與磷脂酰絲氨酸結(jié)合，磷脂酰絲氨酸位于細胞膜的外部小葉上，導(dǎo)致染色強度增加。
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圖1.在Jurkat細胞中檢測膜聯(lián)蛋白VmFluor Violet 450和磷脂酰絲氨酸的結(jié)合活性。 將Jurkat細胞在37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中不用（藍色）或用1μM星形孢菌素（紅色）處理5小時，然后用Annexin V-mFluor Violet 450染色30分鐘。 使用FACSCalibur（Becton Dickinson，San Jose，CA）流式細胞儀，使用紫外激光在Ex / Em = 405 / 450nm下測量膜聯(lián)蛋白V-mFluor Violet 450的熒光強度。