近幾年，二代建庫測序周期已經得到飛速提升，同時第二代短讀長測序技術在測序市場上仍然占有絕對優勢，但第三代測序技術自2008年以來也發展的如火如荼，憑借其獨特的長讀長優勢且測序過程無需進行PCR擴增，實現了對每一條DNA分子的單獨測序，已廣泛應用于基因組拼接、病原體研究和突變鑒定等多種方面。
三代測序之原理篇
第三代測序技術又稱為單分子DNA測序，即通過現代光學、高分子、納米技術等手段來區分堿基信號差異的原理，以達到直接讀取序列信息的目的。目前商業化主流的三代測序技術是Pacific Biosciences公司的SMRT技術和Oxford Nanopore Technologies公司的納米孔單分子技術。與前兩代技術相比，他們最大的特點是單分子測序，其中SMRT技術利用熒光信號進行測序，而納米孔單分子測序技術利用不同堿基產生的電信號進行測序。
三代測序之應用篇
目前長讀長測序的三代測序平臺，已廣泛應用于復雜動植物基因組、微生物基因組、全長轉錄組、微生物群體研究及人類基因組變異檢測等領域的科研項目中，以解決這些科研領域檢測技術瓶頸的問題。在臨床疾病檢測方面，三代測序技術在基因組結構變異、短串聯重復/微衛星、甲基化檢測等遺傳病及腫瘤基因檢測相關領域具有獨到的優勢，目前基于三代測序技術的遺傳病基因診斷產品層出不窮。
三代文庫制備之DNA/RNA QC
提取后DNA/RNA的質量會影響文庫制備，因為選擇不同的提取方法，DNA/RNA樣品中會有不同的化學試劑殘留可能抑制酶的活性，同時DNA/RNA的完整性影響下游文庫制備效率，進而影響測序質量。
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純度：DNA/RNA純度較高，無RNA或DNA、蛋白質污染（需專門適配長片段提取試劑盒）；
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濃度：大于等于30 ng/uL；
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完整性：無降解，DNA脈沖場凝膠分析測量的平均片段大小>30kb，RNA RIN≥8；
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樣品量：DNA大于等于1 μg（不同數據量需求略有不同）；
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建議使用TE緩沖液長期儲存高分子量（HMW）gDNA。
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三代文庫制備之數據質控
不同于二代測序的堿基質量標準Q20/Q30，三代測序由于其隨機分布的堿基錯誤率，其單堿基的準確性不能直接用于衡量數據質量。最直接的方法是看長度。長度短的測序數據不一定差（與文庫大小有關），但差的數據長度一定短。在上游測序，最關鍵的影響因素是文庫的構建。高質量的文庫產出的數據長度長，質量好；而低質量的文庫產出的數據長度短，質量差。
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PacBio 測序數據QC：數據產出（G）、酶讀長、插入片段長度、subreads N50
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nanopore測序數據QC：數據產出（G）、平均讀長、平均質量值（Q）、Read length N50、最長reads長度及質量值，最重要的兩個指標為長度分布與平均Q值。
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翌圣生物匠心研發多款適配Nanopore平臺的建庫試劑盒滿足眾多客戶的不同需求，助力科學研究和臨床檢測更精準、更快捷！
翌圣三代建庫產品選擇指南
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產品類別 |
產品名稱 |
貨號 |
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連接法建庫 |
13301ES |
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末修加A模塊 |
Hieff® DNA Endprep&dA-Tail Module for ONT |
13302ES |
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Barcode接頭連接模塊 |
Hieff® DNA Endprep&dA-Tail Module for ONT |
13303ES |
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馬達蛋白接頭連接模塊 |
Hieff ® Adapter Ligation Module for ONT |
13304ES |
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片段化/末修/加A模塊 |
13309ES |
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長片段高保真擴增酶 |
Hieff NGS® Multiplex Long PCR Master Mix |
17228ES |
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配套建庫產品 |
Hieff NGS® DNA Selection Beads 分選磁珠(完美替代AMPure XPBeads) |
12601ES |
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1×dsDNA HS Assay Kit |
12642ES |