國家自然科學基金可以幫助研究型臨床醫生和科學家成長，在成長過程中國自然標書的申請，以及成果的轉化，是一個永恒的話題。我們知道，國自然的轉化成果類型包括：期刊論文、**、會議論文、獎勵、專著。那么工具病毒是如何助力老師們的國自然成果轉化呢？為了便于老師們理解工具病毒的功能與應用場景，我從國自然官網上檢索出了腺相關病毒^[1]、慢病毒^[2]、腺病毒^[3]助力，國自然成果轉化的期刊論文，進行簡要解讀。

工具病毒的主要功能有助力發現靶點、標記細胞、操控基因、遞送基因表達元件等。為了保護國自然主要參與者的權益，在本篇軟文中，我只對已經發表出來的期刊論文進行解讀，展示工具病毒的應用場景。如果老師們對國自然標書感興趣，可以去國自然官網檢索相關內容。

本文來源于國自然官網中，血管穩態失衡中的細胞命運轉變及調控機制研究。

低密度脂蛋白受體(LDLR)突變是家族性高膽固醇血癥(FH)的主要原因之一，FH可誘發動脈粥樣硬化，終生患心血管疾病的風險很高。CRISPR/Cas9系統是一種有效的基因編輯工具，可以糾正基因突變，從而改善疾病。具體是怎么操作的呢？

1. Ldlr^E208X基因敲入點突變小鼠的建立與驗證

在LDLR的18個外顯子中，絕大多數基因突變發生在第4個外顯子中。之前的研究中已證明，FH患者中E207X（G to T的點突變，GAG-TAG），導致了LDLR的無義點突變（Figure 1A）。為了構建Ldlr^–/–基因敲入小鼠模型，作者借助CRISPR-Cas9技術在小鼠受精卵中，通過同源定向修復產生一個，相當于人類Ldlr基因的E207X突變（Figure 1C）。為了驗證Ldlr^–/–模型是否成功建立，作者借助一代基因測序、qPCR、WB和免疫熒光實驗，證實Ldlr^–/–模型成功建立，可以用于后續實驗。

2.高脂飲食方案后Ldlr^E208X小鼠，出現動脈粥樣硬化

LDLR蛋白在從血清中吸收低密度脂蛋白，從而調節循環系統中的膽固醇水平方面起著至關重要的作用。我們在Ldlr^E208X雄性小鼠和野生型雄性小鼠6周齡時開始喂食12周的高脂飲食(Figure 2A，2B)。高脂飼料喂養12周后，兩組小鼠體重均有所增加，但Ldlr^E208X小鼠在高脂飼料喂養6周及以后的體重均顯著高于野生型對照組。HE染色和油紅O染色結果顯示：主動脈動脈硬化程度，肝臟中脂質蓄積程度高于對照組（Figure 2C，2E，2I）。免疫熒光結果顯示：平滑肌細胞標志物，包括α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)、平滑肌蛋白22α (SM22α)、平滑肌肌球蛋白重鏈(SM-MHC)和鈣鈣蛋白，顯示這些SMC細胞骨架蛋白在動脈粥樣硬化斑塊中顯著降低甚至丟失，代表著從收縮型到合成型的變化，稱為平滑肌細胞表型改變；此外，巨噬細胞（F4/80）進入損傷區（Figure 2G）。血漿中的總膽固醇含量、甘油三酯含量以及LDL-膽固醇含量，均高于對照組（Figure 2K）。這些數據表明：Ldlr^E208X的病理特點與FH的臨床特點高度相似。

3.經過基因治療的Ldlr^E208X小鼠，肝臟中LDLR表達水平得到部分恢復

由于AAV血清型8具有高特異性和高效率地轉導肝細胞，作者建立了AAV8-CRISPR/Cas9系統來靶向點突變，旨在部分恢復Ldlr^E208X小鼠肝臟中LDLR的表達（Figure 3A）。作者設計了實驗組（將兩種AAV的混合物，包括5E+11vg的AAV-sgRNA-Donor和5E+10vg的AAV-Cas9）于對照組（Figure 3B）。為了評估AAV8-CRISPR/Cas9介導的基因編輯的準確性，作者使用了深度測序來分析靶上和靶外位點。在25%的Ldlr等位基因中檢測到indels，在治療組的6.7%的Ldlr等位基因中，觀察到HDR介導的T-G突變的糾正（Figure 3C）。為了從多角度評估基因編輯效果，作者借助RT-PCR、qPCR、WB、IF（Figure 3D-3G）證明AAV8-CRISPR/Cas9介導的Ldlr體內基因編輯，可以部分Ldlr^E208X小鼠肝臟中LDLR的表達。

4. AAV-CRISPR/Cas9治療后Ldlr^E208X小鼠后，動脈粥樣硬化得到改善

為了進一步評估AAV-CRISPR/Cas9介導的基因校正療法，對人類FH治療的轉化作用。作者分析了各組小鼠，在高脂飲食后的動脈粥樣硬化和血漿膽固醇水平。平均而言，各組小鼠體重均有增加，但AAV-CRISPR/Cas9治療組小鼠的體重，顯著低于組1和組2，但與野生對照小鼠沒有明顯差異（Figure 4A、4B）。緊接著，作者進行了主動脈的油紅O染色、SMA、Ve-cad免疫染色，治療組的動脈硬化板塊負擔、主動脈中膜的脂質堆積、平滑肌層的破壞明顯減輕（Figure 4C、4D、4E）。肝臟和血液系統里的脂質水平檢測，實驗組也顯著優于對照組（Figure 4F-4J）。最終，這些數據證明了，AAV-CRISPR/Cas9在Ldlr突變基因校正中的有效性，以及臨床轉化的可行性（Figure 5）。

本文來源于國自然官網中，受體酪氨酸激酶對腫瘤靶向治療耐藥性進展過程調控機研究。

靶向KRAS途徑是一種有前景但具有挑戰性的結腸直腸癌治療方法。盡管MEK抑制劑在BFAF突變的黑色素瘤中顯示出強大的療效，但由于其內在的代償信號，MEK抑制劑似乎被結直腸癌細胞所耐受。

多種高通量全基因組篩選方法已被應用于識別導致人類癌癥耐藥性的關鍵基因。此前，利用shRNA文庫篩選RNA干擾，敲除靶向基因已被廣泛應用。然而，基因敲除效率低下和脫靶效應限制了它們的應用。近年來，慢病毒介導的CRISPR-Cas9文庫系統在基因組編輯技術上的創新提供了一種新的思路?？朔@些限制的另一種方法。它已被用于在體外和體內識別對癌細胞存活、增殖和靶向耐藥至關重要的基因。因此，我們進行了全基因組CRISPR/Cas9敲除篩選，以確定關鍵的致癌基因，克服CRC細胞中的MEKi抗性。進一步，我們進行了MEK和PLK1激酶的聯合靶向研究，以研究其在體外和體內對CRC的影響。我們的發現不僅有助于闡明結直腸癌對MEK靶向治療的原發性耐藥機制，而且還為臨床治療提供了一種組合方案。那么，作者是如何證明的呢？

1. RTK途徑介導KRAS突變型結腸癌的MEKi耐藥性

為了識別與MEKi抗性相關的關鍵驅動基因，作者選擇了直腸癌的腫瘤細胞系，設計了與全基因組CRISPR-Cas9的組合策略，KRAS突變細胞系的敲除文庫篩選和轉錄組學分析（Figure 1A）。為了保持大約500* sgRNA的覆蓋率，2E+8的穩定表達Cas9蛋白的細胞，被人GeCKO文庫，雙載體慢病毒系統感染。通過控制感染MOI接近0.3，嚴格控制每個細胞的單基因敲除。嘌呤霉素篩選后，細胞分別用DMSO或AZD6244（MEKi）處理7天。

隨后，包含sgRNA的基因組DNA，通過PCR擴增和高通量測序。作者假設驅動抗性的基因在AZD6244處理的細胞中被有效轉錄，因此初步鑒定的TPM值大于10的基因，被確定為自信候選基因?；谶@一策略，作者篩出了靶向1846個基因的sgRNAs?；虮倔w（Gene Ontology, GO）富集分析結果顯示,這些基因主要分布在跨膜受體蛋白酪氨酸激酶信號通路（RTK通路）、NF-κB通路、TGF-β通路和外源性凋亡調節通路（Figure 1B）。CRC細胞的轉錄組分析顯示，在MEKi處理后，RTK基因的表達模式顯著中斷（Figure 1C、1D）。

此外，基因集富集分析（GSEA）也發現，在MEKi處理的CRC細胞中，RTK通路基因的表達顯著上調（Figure 1E）。為了進一步證實這一結果，作者對MEKi處理后的RTK通路中的蛋白進行了WB分析，結果顯示：EGFR, MET, FAK, STAT3, and AKT的磷酸化水平顯著上調。這些數據表明RTK通路在MEKi抗性中起關鍵作用，后續的實驗作者將研究的焦點聚焦在RTK通路上。

作者通過文庫病毒，篩出了本文的研究靶點，又通過生信分析，進一步鎖定了RTK-GRB7-PLK1通路，借助高通量測序、組學、免疫熒光、流式分析、藥學分析等技術驗證后，最終作者得出結論RTK-GRB7-PLK1通路與MEK的聯合抑制，為結腸癌患者的治療提供了一種有前景的策略。在當下這個時代，很多實驗室在機制的發現和驗證，已經具備了成熟的體系，而文庫病毒的出現，加速了發現新靶點的進程，使得工具病毒成為助力老師們科學研究的強有力的工具。

溶瘤腺病毒(OAs)在癌癥病毒基因治療中的臨床研究顯示出了巨大的潛力。迄今為止，臨床試驗表明，OAs的療效仍然受到肝臟隔離和先前存在的中和抗體的限制，這些中和抗體減少了OAs在腫瘤中的積累^[3]。

為此，科學家嘗試了很多方法。1.開發新的血清型Ad5.5，盡管特異性極強，工藝繁瑣，難以量產；2.通過化學修飾封裝病毒，像三甲基-氨丙烷氯鹽（DOTAP）、聚乙二醇（PEG）等，這種方法可能導致病毒的毒性增加，因為一些帶正電的聚合物可以結合血液中帶負電的蛋白質；3.生物礦化是自然生物系統中普遍存在的現象，具有使生物有機體和無機物質結合的顯著優勢，不僅保留了生物有機體的活性，而且賦予了它們更多的功能生物礦化策略，一般應用于在適度條件下對生物體(包括病毒)的修飾。

1.OA-Trail@SiO₂的合成與表征

病毒表面帶負電荷的蛋白質與帶正電荷的PEI形成靜電吸引，并在病毒表面形成礦化位點（Figure 1A）。經過專業材料學方面的評估（Figure 1BCDE）與斑點雜交試驗表明，硅膠外殼可以屏蔽六邊形蛋白，并阻止特定抗體對OA-Trail的識別(Figure 1F)。在pH值為7.4的條件下，未處理的OA出現斑痕，但由于OA表面有二氧化硅涂層，在OA@SiO₂位置沒有斑痕。在pH為5.6的條件下，重新出現了OA@SiO₂位置的斑點標記，表明硅膠涂層被降解，OA被重新暴露。此外，降解實驗結果還表明，OA@SiO₂的二氧化硅涂層被降解，OA恢復正常。

2. OA-Trail@SiO₂的體外抗腫瘤作用

感染實驗是驗證病毒傳染性最直觀的實驗，因此研究了礦化OA-Trail對Hep-G2細胞的細胞病變作用。結果表明，在感染72h時，OA-Trail和OA-Trail@SiO₂具有相似的感染能力。用OA-Trail@SiO₂處理的Hep-G2細胞變圓并開始脫落，與對照組相比，顯示出顯著的病理效應(Figure 2A)，這表明礦化過程是生物相容性的，幾乎不影響病毒的活力和感染性。結果顯示，在感染后48小時，兩種病毒之間沒有差異，因為細胞在48小時已經完成了病毒的分離；然而，在24小時時，OA-Trail@SiO₂-treated細胞顯示出明顯高于原生OA-Trail處理的細胞的病毒濃度(Figure 2B)，表明納米病毒的細胞內吞效率很高。此外，共聚焦顯微鏡圖像還顯示，在預感染階段，“二氧化硅涂層”加速了細胞對病毒的吸收過程(Figure 2C、2D)。

3. OA-Trail@SiO₂在體內的生物分布

大多數Ad5菌株會在靜脈注射后3分鐘內定位于肝臟。因此，為了觀察血液中病毒的存在，我們將OA-Trail或合成的OA-Trail@SiO₂材料系統地注射到小鼠體內，并采用實時定量PCR (real-time quantitative PCR, qPCR)方法觀察結果。正如所料，OA-Trail@SiO₂從血液中清除的過程明顯慢于OA-Trail(Figure 4A)，但在OA-Luc@SiO₂治療組，靜脈注射后第2天，肝內熒光信號明顯減弱，腫瘤內熒光信號明顯高于OA-Luc治療組(Figure 4B、4C)。這些結果也表明“二氧化硅涂層”對防止病毒向肝有積極作用。接下來，通過qPCR觀察腫瘤和肝臟中病毒的存在，腫瘤和肝臟中E3 RNA拷貝的結果與腫瘤和肝臟的熒光成像結果呈現相同的趨勢(Figure 4D)。為了表明生物硅化改善了病毒在體內的生物分布，計算了E3 RNA拷貝的腫瘤/肝臟比值，與OA-Luc處理的小鼠相比，該比值在OA-Luc@SiO₂治療的小鼠中增加了約30倍(Figure 4E)。這些結果表明，由于“二氧化硅涂層”的保護作用，系統給藥OA@SiO₂在體內的生命周期較長，這意味著OA@SiO₂的腫瘤積累量高于OA本身。

4. OA-Trail@SiO₂顯示了逃脫免疫清除的能力

血液中腺病毒特異性的抗體阻礙了OA-Trail在基因治療中的應用，這種抗體中和降低了病毒的活性和轉基因的表達。作者研發了“二氧化硅涂層”是否在中和試驗中保護病毒免受抗體識別。熒光顯微鏡下對Hep-G2細胞的GFP熒光信號分析表明，當中和抗體大量存在時，Ad5增強的綠色熒光蛋白(EGFP)處理的Hep-G2細胞中GFP的表達明顯受到阻礙，但Ad5-EGFP@SiO₂治療的Hep-G2細胞中GFP的表達受到抑制。在同樣的情況下，細胞仍有較高的GFP表達(圖5A)。流式細胞術分析結果還顯示，在GFP平均熒光強度水平下，Ad5- EGFP@SiO₂治療的細胞的熒光強度高于Ad5-EGFP處理的細胞(圖5B和C)。這些結果表明，“二氧化硅涂層”在體外消除了中和抗體對病毒的識別。

5. OA-Trail@SiO₂增強體內抗腫瘤作用

在分析OA-Trail@SiO₂靜脈給藥的生物分布的基礎上，進一步在裸鼠Hep-G2移植瘤模型中評估OA-Trail@SiO₂的抗腫瘤能力。小鼠每隔一天靜脈注射PBS、OA-Trail或OA-Trail@SiO₂，當腫瘤體積達到100mm³時，共注射3次(2×10¹⁰vps /次)。

陰性對照PBS治療后，腫瘤平均體積在27天后增長到約1646mm³。然而，與PBS相比，OA-Trail@SiO₂治療顯示明顯的腫瘤生長抑制(TGI：69.0%)（Figure 6A）。相反，OA-Trail的抗腫瘤作用不明顯，TGI值僅為25.8%，但在體外對腫瘤細胞表現出相當大的毒性(Figure 3A)。然后對腫瘤切片進行蘇木素和伊紅(HE)染色、免疫組化染色和TUNEL分析，研究OA-Trail@SiO₂在體內對腫瘤細胞凋亡的誘導作用(Figure 6C)。在OA-Trail@SiO₂治療的腫瘤切片中，OA的hexon蛋白清晰可見，Tr表達高觀察治療期間的情況(Figure 6B)。這些結果表明，靜脈注射OA-Trail@SiO₂可有效到達腫瘤并表達Trail基因，導致腫瘤細胞凋亡。

綜上所述，利用生物硅化方法，在溫和條件下成功構建了OA@SiO₂核殼結構。重要的是，該策略改善了全身給藥后OA的生物分布，顯著降低了肝毒性。此外，合成的OA@SiO₂在“二氧化硅涂層”的保護下可以逃脫免疫清除。我們觀察到OA@SiO₂具有較長的血液循環時間，高效的OA在腫瘤中的積累和體內抗腫瘤作用。這些結果表明，OA@SiO₂作為一種新的腫瘤病毒基因治療策略具有巨大的應用潛力。

本文通過在國自然官網，檢索出3篇由國自然課題，轉化而來的科研成果。AAV、LV、Ad助力老師們發表了期刊論文，向科研道路上，邁出了扎實的一步。希望科學家不斷研發出的更為高效的工具病毒，為老師們的研究，走出一條星光大道。

【參考文獻】

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2. Yu C, Luo D, Yu J, Zhang M, Zheng X, Xu G, Wang J, Wang H, Xu Y, Jiang K, Xu J, Ma X, Jing J, Shi H. Genome-wide CRISPR-cas9 knockout screening identifies GRB7 as a driver for MEK inhibitor resistance in KRAS mutant colon cancer. Oncogene. 2022 Jan;41(2):191-203. doi: 10.1038/s41388-021-02077-w. Epub 2021 Oct 30. PMID: 34718347; PMCID: PMC8732282.

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