（圖片來源于https://voice.baidu.com/act/newpneumonia/newpneumonia/?from=osari_pc_3）
由于新病例的迅速增加，2019年冠狀病毒（SARS-CoV-2）很快引起了全球關(guān)注。根據(jù)新型冠狀病毒肺炎疫情實(shí)時(shí)大數(shù)據(jù)報(bào)告，截至7月31日18時(shí)，全國累計(jì)報(bào)告確診病例88077例，現(xiàn)有確診病例2195例，境外輸入2063例；海外現(xiàn)有確診病例5867747例。這些數(shù)字每天都會(huì)更新，而且預(yù)計(jì)可能還會(huì)進(jìn)一步增加。迫切需要一種有效的預(yù)防該病毒的疫苗。
2020年7月29日，四川大學(xué)華西醫(yī)院生物治療國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室博士生導(dǎo)師魏霞蔚、逯光文和澳門科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院教授張康共同通訊在Nature 在線發(fā)表題為“Avaccine targeting the RBD of the S protein of SARS-CoV-2 induces protective immunity”的研究論文，這也是Nature雜志發(fā)表的第一篇新冠疫苗研究論文。該研究通過質(zhì)譜分析（并使用GPSeeker軟件分析完整的N-糖肽和聚糖）、表面等離振子共振、肺部組織的病理學(xué)分析等研究技術(shù)發(fā)現(xiàn)了SARS-CoV-2疫苗設(shè)計(jì)中S蛋白中RBD結(jié)構(gòu)域的重要性，并為通過誘導(dǎo)針對RBD結(jié)構(gòu)域的抗體開發(fā)保護(hù)性疫苗提供了依據(jù)。
下面我們一起來詳細(xì)解讀下這篇研究論文。
（圖片來源于https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/32726802/）
一、背景介紹
SARS-CoV-2是2019年在人體中發(fā)現(xiàn)的冠狀病毒新毒株，到如今仍然在全球肆虐，給人們的健康以及全球的經(jīng)濟(jì)發(fā)展造成了災(zāi)難性的影響。如何治療和預(yù)防這種疾病，成為了全世界最關(guān)心的事情之一。開發(fā)一種可行的疫苗，變得非常有必要，也是事在必行的事情。目前全球有很多醫(yī)療公司、科研院所都在致力于新型冠狀病毒疫苗的研發(fā)。
前面已經(jīng)有大量的文章報(bào)道，新型冠狀病毒感染過程中的關(guān)鍵步驟是：SARS-CoV-2利用其S蛋白的受體結(jié)合域(S-RBD）與宿主細(xì)胞受體血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(ACE2)發(fā)生作用，從而侵染宿主細(xì)胞。
基于前面的研究和對病毒包膜蛋白的了解，作者假設(shè)受體結(jié)合域（RBD）是一種良好的免疫原，并可以觸發(fā)有效的功能性抗體反應(yīng)，從而在體外中和SARS-CoV-2。在這篇文章中作者用S-RBD的319-545殘基組成的疫苗，在動(dòng)物體內(nèi)有很好的免疫應(yīng)答，其產(chǎn)生的抗體在體外能阻斷RBD與細(xì)胞表面表達(dá)的ACE2結(jié)合，并中和了SARS-CoV-2假病毒和SARS-CoV-2活病毒的感染。這些發(fā)現(xiàn)凸顯了RBD結(jié)構(gòu)域在SARS-CoV-2疫苗設(shè)計(jì)中的重要性，并為通過誘導(dǎo)針對RBD結(jié)構(gòu)域的抗體開發(fā)保護(hù)性疫苗提供了依據(jù)。
二、RBD蛋白表達(dá)及相關(guān)研究
1、使用昆蟲細(xì)胞和Bac-to-Bac 桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)制備SARS-CoV-2刺突蛋白的重組受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域（RBD）。
2、從培養(yǎng)上清液中純化重組RBD蛋白，其純度超過98％（圖1b）。SDS-PAGE顯示純化的RBD蛋白的表觀分子量為34 kDa，比理論上的RBD氨基酸序列的分子量（約27 kDa）大約1/4，由于刺突蛋白是糖蛋白，故作者認(rèn)為RBD區(qū)域可能存在密集的蛋白糖基化修飾。
3、通過質(zhì)譜（MS），使用GPSeeker軟件分析完整的N-糖肽和聚糖。在天冬酰胺上鑒定出三個(gè)N-糖基化位點(diǎn)（圖1c），其中N331和N343兩個(gè)位點(diǎn)已有文獻(xiàn)報(bào)道；此外，還使用SEQUEST分析MS結(jié)果，來評估O-糖基化位點(diǎn)，總共鑒定出十個(gè)O-糖基化位點(diǎn)。
4、將這些鑒定出的糖基化位點(diǎn)進(jìn)一步定位在與ACE2結(jié)合的SARS-CoV-2 RBD的結(jié)構(gòu)上。結(jié)果表明大多數(shù)糖基化修飾位點(diǎn)位于RBD核心子域上，且所有位點(diǎn)都遠(yuǎn)離結(jié)合的ACE2（圖1e），這表明修飾的聚糖可能不會(huì)干擾RBD蛋白與受體的識(shí)別與結(jié)合。
5、作者進(jìn)一步通過表面等離振子共振技術(shù)驗(yàn)證了重組RBD蛋白與ACE2的親和性，結(jié)果表明RBD以高親和力與ACE2結(jié)合，這很好地反映出了重組RBD蛋白有天然構(gòu)象。
三、RBD蛋白免疫動(dòng)物獲取抗血清并體外驗(yàn)證重組表達(dá)抗體的效果
1、采用明礬作為佐劑，用不同的免疫劑量（0.1至20μg）和免疫方案免疫小鼠。并采用ELISA技術(shù)檢測評估重組RBD誘導(dǎo)的體液免疫反應(yīng)效果。
2、接種后第7天獲得的血清已經(jīng)顯示出對重組RBD的IgG和IgM應(yīng)答升高（圖2a）。相反，來自免疫前的血清以及來自PBS和Alum免疫作為對照的血清僅具有背景水平的抗體反應(yīng)。血清的抗體水平，隨著免疫的RBD蛋白劑量增加而增加，兩者在一定范圍類存在劑量依賴（圖b）
3、然后作者用SARS-CoV-2假病毒去測試血清抗體活性，同樣得到較好的結(jié)果。接著作者選取了20位健康和16位COVID-19患者的血清檢測重組RBD免疫得到的IgG和IgM，也顯示出RBD重組抗體對病毒RBD蛋白的高響應(yīng)和親和性（圖e）。
四、進(jìn)一步測試抗血清對RBD與ACE2結(jié)合的阻斷作用
1、在添加或不添加免疫血清的Huh7細(xì)胞培養(yǎng)體系中 ，以1：5的稀釋度將重組SARS-CoV-2 RBD-Fc融合蛋白添加到ACE2陽性的Huh7細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)免疫后的血清能大大減少RBD-ACE2陽性細(xì)胞的比率，抑制RBD與ACE2的結(jié)合。
2、然后偽病毒中和實(shí)驗(yàn)，在添加獼猴免疫血清的293T ACE2陽性細(xì)胞中，免疫血清可以完全阻止SARS-CoV-2假病毒的與細(xì)胞的結(jié)合。
3、接下來，測試了接種RBD免疫血清（疫苗）的非人類靈長類動(dòng)物是否可以阻斷活SARS-CoV-2的感染。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)接種RBD疫苗后，在對動(dòng)物的肺組織、咽拭子、肛門拭子的檢測中，都未檢測到或者檢測到較低水平的病毒基因組RNA（gRNA）和病毒亞基因組RNA（sgRNA，指示病毒復(fù)制），而對照組（未接種RBD疫苗）檢測到比較高含量的gRNA和sgRNA。此外，通過對不同接種量的比較，研究者還發(fā)現(xiàn)，當(dāng)接種疫苗量提高時(shí)，其檢測到的gRNA和sgRNA量會(huì)減少。
4、對肺部組織的病理學(xué)分析也表明，未接種RBD疫苗的肺組織出現(xiàn)明顯的COVID-19癥狀，而接種RBD疫苗的肺組織則沒有顯現(xiàn)出明顯的病理學(xué)變化。
綜上所述，作者發(fā)現(xiàn)重組RBD蛋白具有良好的體液反應(yīng)效果，像Alum這樣的簡單疫苗佐劑可以進(jìn)一步增強(qiáng)免疫反應(yīng)，其血清抗體與ACE2有共同結(jié)合表位；RBD疫苗具有很強(qiáng)的病毒中和活性，可以保護(hù)非人類靈長類動(dòng)物免受SARS-CoV-2活病毒的攻擊；在非人類靈長類動(dòng)物中的毒理學(xué)研究表明，該候選疫苗是安全的。另外，這種重組RBD疫苗方法在技術(shù)上和商業(yè)上都是能大規(guī)模生產(chǎn)和制造的。
所有這些特征都支持該候選疫苗的在進(jìn)一步開發(fā)方面具有極好的前景。總之，作者的發(fā)現(xiàn)突出了SARS-CoV-2疫苗設(shè)計(jì)中S蛋白中RBD結(jié)構(gòu)域的重要性，并為通過誘導(dǎo)針對RBD結(jié)構(gòu)域的抗體開發(fā)保護(hù)性疫苗提供了依據(jù)。
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金開瑞糖基化修飾鑒定
糖基化是在酶的控制下在蛋白質(zhì)或脂質(zhì)上附加糖類的過程，起始于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，結(jié)束于高爾基體。在糖基轉(zhuǎn)移酶作用下將糖轉(zhuǎn)移至蛋白質(zhì)，和蛋白質(zhì)上的氨基酸殘基形成糖苷鍵，并在糖基轉(zhuǎn)移酶和糖苷酶的剪切、加工下形成各種類型的糖鏈。
糖基化蛋白質(zhì)組學(xué)的核心任務(wù)是利用組學(xué)的手段，從全局上去尋找發(fā)生糖基化修飾的位點(diǎn)，解析糖鏈的結(jié)構(gòu)，鑒定完整的糖肽，探索糖蛋白在生命活動(dòng)中扮演的角色和生物學(xué)功能。
基于GPSeeker軟件的糖基化修飾鑒定
（圖片引自Site- and Structure-Specifific QuantitativeN-Glycoproteomics UsingRPLC-pentaHILIC Separationand the Intact N-Glycopeptide SearchEngine GPSeeker）
優(yōu)勢小結(jié)
基于GPSeeker軟件的糖基化修飾鑒定
1、除了能夠確定蛋白發(fā)生糖基化修飾的位點(diǎn)外，還能依賴開發(fā)的”GPSeeker”搜庫軟件對該位點(diǎn)發(fā)生糖基化修飾的糖鏈結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析；
2、能知道發(fā)生糖基化修飾位點(diǎn)上的完整糖鏈信息；
3、基于完整N-糖肽液-質(zhì)聯(lián)用分析特征所發(fā)展穩(wěn)定同位素標(biāo)記可實(shí)現(xiàn)疾病差異表達(dá)糖基化的相對和絕對定量。