題目：Cell-specific proteome analyses of human bone marrow reveal molecular features of age-dependent functional decline
期刊：Nature Communications
影響因子：12.353
主要技術：TMT，Label free
研究背景
組織和器官老化的根本原因是干細胞的老化，隨著年齡的增長，造血干細胞數量和功能發生顯著變化。轉錄組學在少數細胞群中的相關研究已經提供了潛在證據表明，這些變化和細胞衰老息息相關，但是對內在機制仍然缺乏系統性研究。因此，作者希望能夠系統了解人類造血干細胞和祖細胞（HPC）衰老所涉及的分子機制，提供骨髓細胞網絡內人類衰老過程的蛋白質組學特征圖譜。
研究內容及結果
1. 蛋白質組學分析
作者選擇了59名志愿者，年齡在20-60歲之間，包括45名男性和14名女性，抽取骨髓樣本進行細胞分離，獲得六種細胞群：HPC、LYM（淋巴細胞和前體）、MON（單核細胞/巨噬細胞和前體）、GRA（粒細胞前體）、ERP（紅細胞前體）、MSC（間充質干細胞/wd基質細胞）（圖1a-b）用于后續蛋白質組學分析。
為了同時評估與空間（細胞群）和時間（老化）變化衰老相關的分子變化，作者選擇使用兩種定量蛋白質組學技術——TMT和Label free，對上述六種細胞群進行組學分析（圖1c），共鑒定到12158種蛋白質（圖1d-e）。通過相應亞群的已知細胞類型特異性標記的豐度譜進一步證實了數據集的可靠性（圖2a），并基于其分離相應的細胞類型，驗證分析表明，蛋白質組學數據集是可靠的，可以解決跨細胞群的年齡依賴性差異問題。
作者發現，絕大多數（73.3％）定量蛋白存在于一個以上的細胞群中，其中18.6％在六個亞群中同時存在，這種核心蛋白質組具有基本的管家功能，但它們的豐度在不同的細胞群中不同，特別是在代謝途徑中（圖2c）?？偟膩碚f，核心蛋白質組的不同表達豐度可以區分6個不同的細胞群（圖2b）。
圖1 蛋白質組學實驗設計
圖2 蛋白質組學分析結果
2. 衰老對蛋白質組表達譜的影響
為了研究衰老與蛋白表達變化之間的關系，作者對組學數據進行Spearman's相關性分析，發現衰老與許多蛋白質顯著表達變化相關，而且這些差異表達蛋白與性別無關。此外，不同年齡相關的數據集僅在部分重疊，表明年齡對不同的細胞類型有明顯的影響。這可能反映了所研究的六個細胞群的不同半衰期。
隨后作者基于Reactome數據庫進行通路分析（圖3a），揭示了顯著的細胞類型特異性和年齡相關的蛋白質豐度變化。此外，作者也找到了一些在轉錄組層面報道的衰老標志物，如隨著HPC老化，干擾素調節因子8（IRF8）和DNA甲基轉移酶1（DNMT1）表達量顯著下調。
圖3 不同細胞群中與衰老相關的通路分析
3. 衰老影響HPC碳代謝
作者發現，HPC蛋白質的糖酵解途徑中，糖原分解代謝和脂肪酸β-氧化（FAO）中起重要作用的酶的差異表達與衰老密切相關。這些差異表達蛋白表明老年HPC與年輕HPC相比，代謝活性和特異性代謝合成活性增強（圖4），這是其他五個細胞群所沒有的。值得注意的是，這些蛋白差異表達變化僅影響消耗ATP并將葡萄糖轉化為磷酸二羥丙酮和3-磷酸D-甘油醛的糖酵解途徑的準備階段，以ATP、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）和丙酮酸以及TCA循環的產生為特征的第二階段基本上不受影響（圖4a）。與老化合成代謝趨勢一致，HPCs的代謝組學分析（n?= 10，年齡：21-69歲）顯示磷酸戊糖途徑中的兩種代謝物，5-磷酸核酮糖和5-磷酸核酸在老年HPC中積累的趨勢（圖4b）。總體而言，在HPC中，衰老與中樞代謝途徑的重新布線和代謝中間體的重新布線相關，用于合成代謝過程和表觀遺傳過程中重要的輔因子。
圖4 衰老后碳代謝變化
4. 衰老時骨髓相對于淋巴樣分化較高
作者在HPC群體中發現了17種顯著差異蛋白質，這些蛋白質參與維持多能性或沿著髓系或淋巴譜系的分化。為了表征HPC與年齡相關的功能衰減，作者隨后分析了這些蛋白質豐度隨時間變化的動態變化（圖5a），發現隨著HPC衰老，兩種與淋巴發育和功能直接相關的蛋白質DNTT和BCL11A的表達顯著下調，異二聚體可溶性鳥苷酸環化酶（GUCY1A3和GUCY1B3），即一氧化氮（NO）的下游信號傳導效應物，這兩種蛋白的表達顯著上調。環鳥苷酸通路信號傳導能夠調節造血功能，可能表明分化傾向于髓系。與淋巴細胞分化相關的蛋白如MME、IKZF1和EBF1隨著年齡增加表達量下降（圖5b）。形成鮮明對比的是，與骨髓譜系相關的蛋白質如PTGS1、PSTPIP2和TBXAS1，隨著年齡增加表達量顯著上調（圖5c）。總之，作者證明了參與淋巴發育的蛋白質豐度顯著降低，隨著HPC變老，與髓細胞和血小板分化相關的因子大量增加。
圖5 HPCs中差異表達蛋白隨衰老的變化
研究小結
作者利用TMT和Label free兩種定量蛋白質組學技術，研究衰老過程中HPC細胞群分化與功能衰退以及對骨髓分化的偏向，發現隨著HPC的衰老變化，中心碳代謝途徑特別是糖酵解途徑發生顯著改變，揭示衰老導致骨髓生態位的改變，并削弱了HPC歸巢所涉及的途徑的功能。
解析文獻
Marco L. Hennrich, Natalie Romanov, et al. Cell-specific proteome analyses of human bone marrow reveal molecular features of age-dependent functional decline. Nature Communications, 2018, 9: 4004.
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Label-free是通過比較質譜分析次數或質譜峰強度，分析不同來源樣品蛋白的數量變化，認為肽段在質譜中被捕獲檢測的頻率與其在混合物中的豐度成正相關。因此，蛋白質被質譜檢測的計數反映了蛋白質的豐度，通過適當的數學公式可以將質譜檢測計數與蛋白質的量聯系起來，從而對蛋白質進行定量。
TMT是一種多肽體外標記技術，TMT試劑通過反應基團能夠高效地標記酶解后的肽段。在一級質譜圖中，分子量標準化基團使任何一種TMT試劑標記的不同樣本中的同一肽段表現為相同的質荷比。在串聯質譜中，報告基團優先斷裂，釋放報告離子。每個報告離子都有各自獨特的分子量，并且能夠在MS/MS分析中反應出所標記的多肽的樣品豐度，根據報告離子的信號強度值可獲得樣品間相同肽段的定量信息，再經過軟件處理得到蛋白質的定量信息。
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