編者按 真核生物體內存在數萬種蛋白，各自行使功能，且每種內源性蛋白都有規定壽命，行使完功能后發生降解。泛素化（Ub）是真核生物最普遍的蛋白降解途徑之一，通過對蛋白進行泛素化標記，使其被細胞內相應的酶識別進而降解（此過程可被去泛素化酶DUB逆轉）。以往研究證實泛素化幾乎參與一切生命活動調節，但其對衰老的影響尚不清楚。 2021年7月，德國科隆大學Vilchez. David研究小組在Nature上在線發表了題為“Rewiring of the ubiquitinated proteome determines ageing in C. elegans”的研究論文，作者利用泛素化蛋白組學證實衰老期間去泛素化酶活性增加，導致泛素化水平整體喪失，進而出現隨年齡增長發生的蛋白清除障礙和體內沉積。此外，作者發現通過基因干預或外源性藥物加快蛋白分解，可顯著延長線蟲壽命。 【研究材料】 秀麗隱桿線蟲（平均壽命19天） 野生型線蟲模型（實驗組）：初生時期Day1，青年時期Day5，中年時期Day10，老年時期Day15 長壽命線蟲模型（對照組）：飲食限制以及胰島素/IGF-1信號通路降低（年齡與野生型匹配） 【技術方法】 泛素化蛋白組學 第2步：對不同年齡組線蟲進行泛素化蛋白組學檢測，發現蛋白泛素化修飾層面差異 第3步：分析影響蛋白泛素化的直接因素（E3連接酶和去泛素化酶），鎖定蛋白泛素化修飾程度差異背后原因 第4步：結合基因改造模型，篩選影響線蟲壽命的關鍵蛋白酶體靶標 第5步：功能實驗：揭示兩種關鍵壽命決定因子（IFB-2和EPS-8）調控壽命的分子機制 研究結果 1. 衰老過程中的泛素化蛋白質組發生重塑 作者對不同年齡的野生線蟲和長壽線蟲模型進行泛素化蛋白組學分析，篩選到3373個泛素化修飾肽段（對應1485種蛋白），其中多種Ub肽段水平隨年齡而發生變化。其中，老年野生線蟲發生明顯的泛素化修飾下調，而同年齡長壽線蟲并未出現明顯的泛素化修飾下調，反而伴隨衰老出現泛素化修飾增加。作者進一步進行蛋白印跡分析，發現老年野生線蟲體內泛素編碼基因表達并未發生下調，表明泛素化水平差異并非由于泛素蛋白表達的差異，而是由于泛素化修飾發生丟失。 圖1 隨年齡增長，Ub蛋白質發生重構 2. 伴隨年齡增長，去泛素化酶會減少蛋白泛素化 眾所周知，E3泛素連接酶和去泛素化酶（DUBs）是調控蛋白泛素化水平的直接因素。作者分別比較了兩種酶的在不同組間的變化： 2) 去泛素化酶：線蟲體內存在45種去泛素化酶，其中有14種在老年野生型線蟲體內發生明顯上調，占比31%。 此外，作者發現基因敲除衰老過程中上調的去泛素化酶可改善衰老相關的泛素化修飾丟失，且使用DUB抑制劑RP-619可提高老年線蟲體內泛素化水平，并延長其壽命。 圖2 抑制失調DUB可改善老年野生型線蟲Ub蛋白水平，延長平均壽命 3. 隨著年齡的增長，蛋白酶體靶標降解受阻，影響線蟲壽命 作者篩選出192種蛋白質，發現其在衰老過程中至少存在1個賴氨酸位點的泛素化程度減低，而蛋白質總表達水平增加。作者推測這種失衡的蛋白累積是由于泛素化水平降低阻礙了蛋白酶體的識別和降解。為證明上述假設，作者整合了蛋白酶體基因改造的年輕線蟲和未經處理的老年線蟲數據，從中鑒定出10種年齡相關的蛋白酶體靶標。其中HSP-43和USP5敲除導致線蟲壽命縮短，其余8種蛋白 （IFB-2、EPS-8、RPL-4、M01G12.9、C46C2.2、F54D1.6、DDI-1、LEC-1）敲除導致線蟲壽命延長。 圖3 年齡相關的去泛素化會損害長壽調節劑的靶向降解 令人興奮的是，IFB-2和EPS-8敲除對線蟲壽命的影響最大。為證實IFB-2和EPS-8中泛素化喪失與壽命調節的直接聯系，作者通過生成賴氨酸（K）-精氨酸（R）突變體來阻斷內源性IFB-2和EPS-8的泛素化。結果證實，與年齡相關的去泛素化和隨后的IFB-2和EPS-8降解受損決定了線蟲壽命。 圖4 IFB-2和EPS-8水平增加會縮短線蟲壽命 4. 壽命決定因子IFB-2和EPS-8生物學功能解析 IFB-2：作者發現僅在腸道中針對中間絲IFB-2的RNAi可延長壽命，而在其他組織中的RNAi則不影響線蟲壽命。進一步分析發現，IFB-2和其他相互作用的中間絲蛋白形成富含中間絲的層-腸細胞頂端細胞質中的進化保守區域，對腸道形態發生和完整性至關重要。衰老狀態下IFB-2的錯誤定位和聚集導致了腸道完整性的喪失（衰老的特征）。此外，ifb-2的敲低減少了老年線蟲腸道中的細菌入侵，而無泛素化的IFB-2突變則加劇了上述表型。 圖5 增加的 IFB-2 水平會引起與年齡相關的腸道改變 EPS-8：盡管EPS-8在不同組織中的水平均隨年齡增長而增加，但它通過其在肌肉和神經元內的活動調節生物體壽命。作為胞內信號通路底物，EPS-8表達增加會過度激活RAC信號通路，進一步導致激酶JNK磷酸化升高，從而調節參與細胞存活和死亡的轉錄因子。此外，RAC還可促進肌動蛋白細胞骨架的聚合和重塑、增加其不穩定性，最終影響肌肉運動和活動能力。 小結
實驗方法簡介
第1步：構建野生型和長壽的秀麗隱桿線蟲模型，觀察表型
圖6 增加的EPS-8水平通過RAC過度激活縮短壽命
研究人員發現，相比于長壽的秀麗隱桿線蟲模型，野生型線蟲隨著年齡增長往往面臨著蛋白質清除功能障礙問題，其本質是由于泛素化減少和降解缺失導致的蛋白酶體靶標蛋白累積。減少這些伴隨年齡增長而增加的蛋白酶體靶標蛋白可延長壽命，反之則縮短壽命。此外，作者對蛋白酶體靶標進行分析，發現兩種在衰老過程中缺乏泛素標記的蛋白，IFB-2和 EPS-8，并利用基因改造模型明確其參與的生物學功能。綜上，本研究提供了有助于理解衰老和長壽的全面數據集，并發現兩個潛在的抗衰靶標，為后續抗衰藥物研發提供潛在理論基礎。
Nature | 凍齡女神！泛素化蛋白組發現抗衰老新機制
作者：上海中科新生命生物科技有限公司 2021-12-25T18:22 (訪問量:4859)
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