編者按 真核生物體內(nèi)存在數(shù)萬種蛋白，各自行使功能，且每種內(nèi)源性蛋白都有規(guī)定壽命，行使完功能后發(fā)生降解。泛素化（Ub）是真核生物最普遍的蛋白降解途徑之一，通過對(duì)蛋白進(jìn)行泛素化標(biāo)記，使其被細(xì)胞內(nèi)相應(yīng)的酶識(shí)別進(jìn)而降解（此過程可被去泛素化酶DUB逆轉(zhuǎn)）。以往研究證實(shí)泛素化幾乎參與一切生命活動(dòng)調(diào)節(jié)，但其對(duì)衰老的影響尚不清楚。 2021年7月，德國科隆大學(xué)Vilchez. David研究小組在Nature上在線發(fā)表了題為“Rewiring of the ubiquitinated proteome determines ageing in C. elegans”的研究論文，作者利用泛素化蛋白組學(xué)證實(shí)衰老期間去泛素化酶活性增加，導(dǎo)致泛素化水平整體喪失，進(jìn)而出現(xiàn)隨年齡增長發(fā)生的蛋白清除障礙和體內(nèi)沉積。此外，作者發(fā)現(xiàn)通過基因干預(yù)或外源性藥物加快蛋白分解，可顯著延長線蟲壽命。 【研究材料】 秀麗隱桿線蟲（平均壽命19天） 野生型線蟲模型（實(shí)驗(yàn)組）：初生時(shí)期Day1，青年時(shí)期Day5，中年時(shí)期Day10，老年時(shí)期Day15 長壽命線蟲模型（對(duì)照組）：飲食限制以及胰島素/IGF-1信號(hào)通路降低（年齡與野生型匹配） 【技術(shù)方法】 泛素化蛋白組學(xué) 第2步：對(duì)不同年齡組線蟲進(jìn)行泛素化蛋白組學(xué)檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)蛋白泛素化修飾層面差異 第3步：分析影響蛋白泛素化的直接因素（E3連接酶和去泛素化酶），鎖定蛋白泛素化修飾程度差異背后原因 第4步：結(jié)合基因改造模型，篩選影響線蟲壽命的關(guān)鍵蛋白酶體靶標(biāo) 第5步：功能實(shí)驗(yàn)：揭示兩種關(guān)鍵壽命決定因子（IFB-2和EPS-8）調(diào)控壽命的分子機(jī)制 研究結(jié)果 1. 衰老過程中的泛素化蛋白質(zhì)組發(fā)生重塑 作者對(duì)不同年齡的野生線蟲和長壽線蟲模型進(jìn)行泛素化蛋白組學(xué)分析，篩選到3373個(gè)泛素化修飾肽段（對(duì)應(yīng)1485種蛋白），其中多種Ub肽段水平隨年齡而發(fā)生變化。其中，老年野生線蟲發(fā)生明顯的泛素化修飾下調(diào)，而同年齡長壽線蟲并未出現(xiàn)明顯的泛素化修飾下調(diào)，反而伴隨衰老出現(xiàn)泛素化修飾增加。作者進(jìn)一步進(jìn)行蛋白印跡分析，發(fā)現(xiàn)老年野生線蟲體內(nèi)泛素編碼基因表達(dá)并未發(fā)生下調(diào)，表明泛素化水平差異并非由于泛素蛋白表達(dá)的差異，而是由于泛素化修飾發(fā)生丟失。 圖1 隨年齡增長，Ub蛋白質(zhì)發(fā)生重構(gòu) 2. 伴隨年齡增長，去泛素化酶會(huì)減少蛋白泛素化 眾所周知，E3泛素連接酶和去泛素化酶（DUBs）是調(diào)控蛋白泛素化水平的直接因素。作者分別比較了兩種酶的在不同組間的變化： 2) 去泛素化酶：線蟲體內(nèi)存在45種去泛素化酶，其中有14種在老年野生型線蟲體內(nèi)發(fā)生明顯上調(diào)，占比31%。 此外，作者發(fā)現(xiàn)基因敲除衰老過程中上調(diào)的去泛素化酶可改善衰老相關(guān)的泛素化修飾丟失，且使用DUB抑制劑RP-619可提高老年線蟲體內(nèi)泛素化水平，并延長其壽命。 圖2 抑制失調(diào)DUB可改善老年野生型線蟲Ub蛋白水平，延長平均壽命 3. 隨著年齡的增長，蛋白酶體靶標(biāo)降解受阻，影響線蟲壽命 作者篩選出192種蛋白質(zhì)，發(fā)現(xiàn)其在衰老過程中至少存在1個(gè)賴氨酸位點(diǎn)的泛素化程度減低，而蛋白質(zhì)總表達(dá)水平增加。作者推測(cè)這種失衡的蛋白累積是由于泛素化水平降低阻礙了蛋白酶體的識(shí)別和降解。為證明上述假設(shè)，作者整合了蛋白酶體基因改造的年輕線蟲和未經(jīng)處理的老年線蟲數(shù)據(jù)，從中鑒定出10種年齡相關(guān)的蛋白酶體靶標(biāo)。其中HSP-43和USP5敲除導(dǎo)致線蟲壽命縮短，其余8種蛋白 （IFB-2、EPS-8、RPL-4、M01G12.9、C46C2.2、F54D1.6、DDI-1、LEC-1）敲除導(dǎo)致線蟲壽命延長。 圖3 年齡相關(guān)的去泛素化會(huì)損害長壽調(diào)節(jié)劑的靶向降解 令人興奮的是，IFB-2和EPS-8敲除對(duì)線蟲壽命的影響最大。為證實(shí)IFB-2和EPS-8中泛素化喪失與壽命調(diào)節(jié)的直接聯(lián)系，作者通過生成賴氨酸（K）-精氨酸（R）突變體來阻斷內(nèi)源性IFB-2和EPS-8的泛素化。結(jié)果證實(shí)，與年齡相關(guān)的去泛素化和隨后的IFB-2和EPS-8降解受損決定了線蟲壽命。 圖4 IFB-2和EPS-8水平增加會(huì)縮短線蟲壽命 4. 壽命決定因子IFB-2和EPS-8生物學(xué)功能解析 IFB-2：作者發(fā)現(xiàn)僅在腸道中針對(duì)中間絲IFB-2的RNAi可延長壽命，而在其他組織中的RNAi則不影響線蟲壽命。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，IFB-2和其他相互作用的中間絲蛋白形成富含中間絲的層-腸細(xì)胞頂端細(xì)胞質(zhì)中的進(jìn)化保守區(qū)域，對(duì)腸道形態(tài)發(fā)生和完整性至關(guān)重要。衰老狀態(tài)下IFB-2的錯(cuò)誤定位和聚集導(dǎo)致了腸道完整性的喪失（衰老的特征）。此外，ifb-2的敲低減少了老年線蟲腸道中的細(xì)菌入侵，而無泛素化的IFB-2突變則加劇了上述表型。 圖5 增加的 IFB-2 水平會(huì)引起與年齡相關(guān)的腸道改變 EPS-8：盡管EPS-8在不同組織中的水平均隨年齡增長而增加，但它通過其在肌肉和神經(jīng)元內(nèi)的活動(dòng)調(diào)節(jié)生物體壽命。作為胞內(nèi)信號(hào)通路底物，EPS-8表達(dá)增加會(huì)過度激活RAC信號(hào)通路，進(jìn)一步導(dǎo)致激酶JNK磷酸化升高，從而調(diào)節(jié)參與細(xì)胞存活和死亡的轉(zhuǎn)錄因子。此外，RAC還可促進(jìn)肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的聚合和重塑、增加其不穩(wěn)定性，最終影響肌肉運(yùn)動(dòng)和活動(dòng)能力。 小結(jié)
實(shí)驗(yàn)方法簡介
第1步：構(gòu)建野生型和長壽的秀麗隱桿線蟲模型，觀察表型
圖6 增加的EPS-8水平通過RAC過度激活縮短壽命
研究人員發(fā)現(xiàn)，相比于長壽的秀麗隱桿線蟲模型，野生型線蟲隨著年齡增長往往面臨著蛋白質(zhì)清除功能障礙問題，其本質(zhì)是由于泛素化減少和降解缺失導(dǎo)致的蛋白酶體靶標(biāo)蛋白累積。減少這些伴隨年齡增長而增加的蛋白酶體靶標(biāo)蛋白可延長壽命，反之則縮短壽命。此外，作者對(duì)蛋白酶體靶標(biāo)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)兩種在衰老過程中缺乏泛素標(biāo)記的蛋白，IFB-2和 EPS-8，并利用基因改造模型明確其參與的生物學(xué)功能。綜上，本研究提供了有助于理解衰老和長壽的全面數(shù)據(jù)集，并發(fā)現(xiàn)兩個(gè)潛在的抗衰靶標(biāo)，為后續(xù)抗衰藥物研發(fā)提供潛在理論基礎(chǔ)。
Nature | 凍齡女神！泛素化蛋白組發(fā)現(xiàn)抗衰老新機(jī)制
作者：上海中科新生命生物科技有限公司 2021-12-25T18:22 (訪問量:5864)
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