編者按
原發性肝癌（Primary Liver Cancer, PLC）是全球癌癥相關死亡的第三大原因，包括肝細胞癌（Hepatocellular Carcinoma, HCC）、肝內膽管癌（Intrahepatic Cholangiocarcinoma, ICC）及混合型肝細胞-膽管癌（Combined Hepatocellular-Cholangiocarcinoma, CHC）。腫瘤內異質性（Intra-tumor Heterogeneity, ITH）被認為是癌癥治療的主要障礙。先前的研究已經揭示了HCC、ICC和CHC中存在相當程度的基因組異質性，反映了具有不同分子特征的多樣化細胞群，決定了藥物敏感性并可能導致治療失敗。
患者來源的類器官（Patient-derived Organoids, PDO）培養已被證明是一種強大的工具，可以用于再現腫瘤異質性并研究不同癌癥類型中的藥物敏感性，包括PLC疾病建模和藥物篩選。然而，以前的PLC類器官研究受到樣本數量的限制，且缺乏多區域樣本。因此，建立一個大規模的PLC類器官生物庫，對PLC異質性的深入理解和開發新的治療策略，尤其對個性化醫療和精準治療至關重要。
今天，我們分享2024年4月8日由北京大學第一醫院張寧教授團隊聯合北京大學腫瘤醫院吳健民教授團隊、河南省腫瘤醫院張建功團隊、北京大學第一醫院楊興團隊等發表在《Cancer Cell》（IF=50.3）的最新研究——Pharmacogenomic profiling of intra-tumor heterogeneity using a large organoid biobank of liver cancer，該研究建立了一個來自144例肝癌患者的、399個肝癌類器官生物庫，能重現原發性肝癌(PLC)的組織病理學和基因組特征，發現ITH與肝癌患者生存率差和耐藥機制之間的關系；并通過大規模靶向藥的藥敏篩選對靶向藥藥敏進行了分子分型，揭示了c-Jun介導的lenvatinib耐藥機制，發現lenvatinib與c-Jun抑制劑(Veratramine)具有協同抗腫瘤作用，開發了預測藥物反應的生物標志物，確定了侖伐替尼耐藥的機制，為肝癌的精準診療提供了重要指導。
文章題目
Pharmacogenomic profiling of intra-tumor heterogeneity using a large organoid biobank of liver cancer
雜志：《Cancer Cell》（IF=50.3）
發表時間：2024年4月8日
作者：張寧、吳健民、楊興、張建功等
單位：北京大學第一醫院、北京大學腫瘤醫院、河南省腫瘤醫院等
01、研究結果
1. 多區域肝癌類器官生物庫揭示肝癌的組織學、基因組學和轉錄組學特征
圖1
研究團隊對肝癌患者的手術標本進行多點取樣，成功建立了來自144位患者的399個腫瘤類器官生物庫（圖1A）。
基于HE染色，從每個組織樣本中收集1-5個區域進行研究，觀察證實了類器官與親代組織間的組織病理學相似。在HCC患者中，多區域來源的類器官和親本腫瘤組織都顯示HCC標記物（HepPar1/AFP）和ICC標記物（KRT19/EPCAM）；患者來源的類器官異種移植物（PDOX）模型也重現了親代腫瘤的組織病理學。通過免疫熒光、免疫組化，證實了類器官與組織的表型異質性。
接著，研究團隊通過全外顯子組測序（WES）、RNA測序（RNA-seq），從體細胞突變（somatic mutations)、拷貝數變異(copy number alterations, CNA)和轉錄組相似性等多維度，評估類器官生物庫重現PLC組織腫瘤間和腫瘤內的異質性。
結果顯示，腫瘤組織和類器官之間的突變負荷相當，包括TP53，AXIN1和CTNNB1；在腫瘤組織和類器官之間發現87.5%的癌癥相關突變的中位一致性。這表明，類器官的組織病理學特征與親本腫瘤相似，而且能表達肝細胞癌和肝內膽管癌的標志物（圖 1C、D）；通過分析類器官的基因表達譜發現，類器官與親本腫瘤之間存在高度的相關性（圖 1H）。
總之，研究表明，PLC衍生的PDOs保留了親代組織的病理學特征、基因組和轉錄組學特征，有助于探究PLC腫瘤間和腫瘤的異質性（圖1）。
2. 肝癌基因組腫瘤內異質性（ITH）多區域類器官特征分析
圖2
研究人員對32名肝癌患者的多區域類器官進行了基因組分析，發現顯著的基因組異質性。研究人員發現，包括P1、P4、P6和P23在內的一個亞組患者在多區域樣本中腫瘤突變負荷（TMB）存在明顯差異；不同區域的腫瘤樣本在基因突變和拷貝數變化方面存在差異（圖 2A）；一些與肝癌相關的基因在不同區域的表達存在差異（圖 2F）。
為了驗證基因組和相關轉錄組的異質性是否可能導致藥物敏感性的異質性，研究人員用79例患者的、255例PDOs研究了PLC一線藥物索拉非尼（sorafenib）和樂伐替尼（lenvatinib）靶基因的表達，結果顯示，一些患者（如P6和P32），在來自不同區域類器官中的靶基因表達存在很大差異，這表明可能存在腫瘤內藥物反應的異質性。
為了證實這一點，研究人員用這兩種藥物處理P6和P32患者的多個類器官培養物，發現靶基因表達水平降低的區域顯示出更高的耐藥性（圖2）?？傊芯咳藛T揭示了PLC中存在與預后相關的、廣泛水平的基因組ITH，并可能導致對藥物治療的異質反應。
3. 篩選臨床相關藥物預測患者反應，揭示腫瘤內藥物敏感性的異質性
圖3
研究人員在116名患者的376種類器官中篩選出7種PLC相關藥物，包括一線藥物樂伐替尼（lenvatinib）和索拉非尼（sorafenib），二線藥物瑞格拉非尼（reorafenib）和阿帕替尼（apatinib），anti-VEGFR抗體貝伐單抗（bevacizumab），以及靶向具有可操作突變的ICC藥物，包括佩米替尼（pemigatinib，靶向含FGFR2融合/重排的膽管癌）和艾伏尼布 （ivosidenib，靶向IDH1突變的化療難治性膽管癌）。結果顯示，7種篩選藥物的IC50和AUC值之間存在很強的相關性。
接著，研究人員基于類器官藥物敏感性結果與相應臨床反應進行比較，發現臨床反應支持使用類器官的樂伐替尼（lenvatinib）敏感性結果，與索拉非尼（sorafenib）、阿帕替尼（apatinib）的類似比較，也證實了類器官藥物篩選的預測價值。
此外，類器官藥物篩選的結果也通過類器官來源的PDOX模型得到驗證，患者來源的類器官被移植到免疫缺陷小鼠體內，其對樂伐替尼（lenvatinib）的治療均有抑制作用。
最后，研究人員利用藥物篩選結果定量評估了目前臨床上用于PLC患者的七種靶向治療藥物的潛在益處。盡管不同地區的所有衍生類器官的累計敏感性可達到72.9%，但不同區域間來源的類器官藥物敏感性水平和患者敏感性水平之間存在顯著差異（圖3）。
這些結果表明，PLC類器官可以用于預測患者對藥物的反應，為個性化治療提供指導。
4. 分子生物學分析確定預測臨床相關藥物敏感性的表達特征
圖4
基因組異質性已被認為是耐藥的主要因素，研究人員首先探究多區域PDOs基因組異質性與PLC藥物敏感性的關系。與敏感組相比，樂伐替尼耐藥組患者突變ITH明顯偏高，這表明ITH在樂伐替尼治療耐藥中的作用。通過研究基因組ITH與索拉非尼（sorafenib）、瑞格拉非尼（reorafenib）和阿帕替尼（apatinib）敏感性的關系，發現阿帕替尼耐藥組患者的CAN-ITH水平升高。
接著，為了確定生物標志物開發中與藥物反應相關的關鍵基因，研究人員通過機器學習模型解析了肝癌臨床靶向藥的藥敏分子分型，揭示了13個lenvatinib藥敏標記物，包括JUN、HIST1H1E和WNT6A。
此外，研究人員開發了sorafenib、regorafenib和apatinib治療反應的預測性生物標志物，并通過PLC藥物治療的患者和多區域類器官分析來評估生物標志物的臨床作用。其中，7例樂伐替尼治療患者中有6例在特征預測和臨床反應之間展現高度一致的結果，而索拉非尼和阿帕替尼治療患者的結果完全一致（圖4）。
總之，研究人員開發并驗證了對特定藥物反應的多基因表達特征，有助于精確醫療的實施（圖4）。
5. c-Jun介導的樂伐替尼耐藥性
圖5
為了鑒定肝癌一線藥物lenvatinib的耐藥基因，研究人員使用與lenvatinib敏感性顯著相關的基因進行蛋白-蛋白相互作用（PPI）網絡分析。其中，JUN是該PPI網絡的樞紐蛋白，是lenvatinib反應的13個特征基因之一，也是FDA批準的藥物靶標。研究發現，JUN基因表達與lenvatinib治療不敏感性顯著正相關。免疫組化（IHC）分析c-Jun蛋白水平，216個lenvatinib耐藥類器官的C-Jun表達顯著高于160個敏感類器官。
此外，100例患者腫瘤中的c-Jun表達高于其配對的癌旁組織；進一步研究HCC患者（P20）和ICC患者（P94）對lenvatinib治療的反應，結果顯示與敏感類器官相比，lenvatinib耐藥類器官中c-Jun的水平升高，c-Jun敲低可致敏lenvatinib耐藥類器官，c-Jun過表達則敏感性有所減少。
為了揭示c-Jun介導的lenvatinib耐藥的信號通路，研究人員通過對245個與lenvatinib應答顯著負相關的基因進行功能富集分析發現，Wnt和c-JNK信號通路顯著失調。在lenvatinib耐藥類器官中，β-catenin（一種關鍵的Wnt信號調節因子）和c-Jun的表達呈正相關。使用P20（HCC）和P94（ICC）類器官進行功能研究，發現在lenvatinib耐藥類器官中均顯示高水平的c-Jun和β-catenin，而在敏感類器官中則顯示低水平；18.5%的類器官對β-catenin敲低敏感。此外，野生型和突變型β-catenin的過度表達顯著降低了這兩種敏感類器官對lenvatinib治療的敏感性；在lenvatinib耐藥區域，JNK和c-Jun的表達也呈正相關。
這些結果表明，JNK和Wnt/β-catenin可能是c-Jun介導lenvatinib耐藥的上游調控因子（圖5）。
6. c-Jun抑制劑與lenvatinib具有協同抗腫瘤作用
圖6
基于研究團隊發現的lenvatinib和c-Jun抑制劑的協同用藥效果，研究人員設計合成了6種連接lenvatinib和c-Jun抑制劑Veratramine的化合物，合成PKUF-01，并通過體內外實驗證明了其優于lenvatinib的腫瘤殺傷效果。
當PKUF-01與類器官生物庫進一步評估時，發現與lenvatinib治療相比，敏感性顯著提高。通過進一步驗證PKUF-01在類器官PDOX模型中的療效發現，lenvatinib或veratramine治療未能抑制PDOXs，而PKUF-01治療可顯著抑制腫瘤生長。
總之，lenvatinib可以靶向FGFR和其他受體，減弱下游信號以抑制腫瘤生長；然而，受Wnt/β-catenin和JNK途徑調控的c-Jun有助于lenvatinib耐藥。PKUF-01靶向c-Jun在lenvatinib耐藥類器官中顯示出顯著療效，并可能使更多PLC患者受益（圖6）。
02、編者點評
總而言之，研究團隊建立了一個來自144例患者的、399個肝癌類器官生物庫，能重現原發性肝癌的組織病理學和基因組特征，并研究其對多種藥物的敏感性，為患者提供更精準的治療選擇。
研究中對c-Jun作為Lenvatinib耐藥性的介質的發現，為克服臨床治療中的耐藥問題提供了新的靶點。通過合成化合物PKUF-01及其與Lenvatinib的協同效應，開發的預測性生物標志物和聯合治療方案值得未來的臨床研究，以促進肝癌的精準醫療。
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參考文獻
[1] Yang H, Cheng J, Zhuang H, Xu H, Wang Y, Zhang T, Yang Y, Qian H, Lu Y, Han F et al: Pharmacogenomic profiling of intra-tumor heterogeneity using a large organoid biobank of liver cancer. Cancer cell 2024, 42(4):535-551. doi: 10.1016/j.ccell.2024.03.004.