骨平衡由成骨細胞骨形成和破骨細胞骨吸收之間的平衡來維持。這一過程的失調會導致多種疾病，包括骨質疏松癥。然而，其潛在的分子機制并不完全清楚。
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今年四月國家蛋白質中心在Signal Transduction and Targeted Therapy上發表了名為OTUB1 promotes osteoblastic bone formation through stabilizing FGFR2的文章。在這里，研究人員發現去泛素化酶 OTUB1的全局性和條件性成骨細胞敲除會導致低骨量和低骨強度；在骨關節注射AAV9-FGFR2會挽救因為OUTB1缺乏導致的骨量損失?？偠灾琌TUB1 在骨穩態中積極調控成骨分化和礦化。為緩解骨質疏松癥提供了一種光學治療策略。
研究結果
1. OTUB1 缺乏會導致成骨缺陷
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通過對OTUB1基因敲除的小鼠進行胚胎期的表型分析，結果表明OTUB1基因敲除的小鼠體長明顯下降。為了進一步證實成骨細胞受到了OTUB1的特異性的影響，研究人員進一步檢測了胚胎發育E18.5時期基因敲除小鼠的軟骨細胞和破骨細胞的生成，結果表明，OTUB1敲除對破骨細胞沒有影響，主要是由于成骨細胞的缺陷造成的。為了進一步研究OTUB1在成骨細胞中的作用，利用質譜分析發現在OTUB1基因全基因敲除小鼠中觀察到的骨形成延遲主要是由于成骨細胞分化和礦化的缺陷造成的。
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圖1. OTUB1缺乏會導致成骨缺陷
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2. OTUB1通過抑制多泛素鏈的降解來穩定FGFR2
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為了研究OTUB1在調控成骨過程中的潛在機制，首先對OTUB1敲除的小鼠的顱骨的成骨細胞進行RNA-seq分析，發現了一些差異基因。接下來作者利用這些差異基因進行進一步的GO分析。通過KEGG通路分析顯示PI3K-Akt和MAPK信號通過是其中最重要的兩個通路。接下來研究人員發現OTUB1缺失的細胞中FGFR（表皮生長因子受體）2的蛋白表達，但是并不影響它的轉錄情況。OTUB1敲除的小鼠中pSMAD2/3、pSMAD1/5、SMAD1 和 SMAD2/3 蛋白的表達沒有變化。表明OTUB1缺失不會影響成骨細胞發育過程中SMAD2/3和SMAD1/5信號傳導。和對照組相比，KO組的成骨細胞中檢測出FGFR2的泛素化增強。進一步揭示OTUB1介導的FGFR2的調控機制，通過突變E2發現，OTUB1通過抑制E2功能來調節FGFR2的非典型機制。
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圖2.OTUB1通過抑制降解性多泛素鏈穩定FGFR2
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3. OTUB1和SMURF1結合調節FGFR2的泛素化和穩定性
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為了確定與 OTUB1 合作調控 FGFR2 泛素化的新的潛在 E3 連接酶，研究人員查詢了 FGFR2 的泛素化和穩定性。在UbiBrowser 中將 FGFR2 作為底物進行了查詢，查詢結果中神經元表達的下調因子（NEDD）4作為候選的目標。在NEDD4的家族里發現只有Smad泛素化調節因子1（SMURF1）和FGFR2又特異性的相互作用。內源性的FGFR2在成骨細胞（OB）和HEK293細胞中和SMURF1相互作用。接下來通過一系列的免疫印跡實驗，證明了OTUB1減少了SMURF1介導的FGFR2泛素化依賴于 D88 殘基（E2 結合的典型位點）。過量表達 OTUB1抑制了 SMURF1 與 E2 UbcH5C 的相互作用，但對 SMURF1 與其底物 FGFR2 的相互作用沒有影響。這些數據表明，OTUB1-E2相互作用破壞了 E3-E2 相互作用，從而抑制了 FGFR2的泛素化。
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圖3.OTUB1與SMURF1相互作用調節FGFR2的泛素化和穩定性
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4. 表皮生長因子受體 2（FGFR2）可挽救 OTUB1 缺失誘導的骨質流失和成骨缺陷
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接下來作者利用AAV來進一步驗證FGFR2是否是OTUB1在骨骼中的真正的生理靶點，將 AAV9 運載的 FGFR2 注射到兩個月大的 OTUB1 小鼠的膝關節中。注射兩個月后，使用 IVIS 光學成像和 qPCR 檢測了 AAV9 釋放 FGFR2 的效率。OTUB1 CKO 小鼠股骨骨質減少的情況在注射 AAV9-FGFR2 后，小鼠股骨骨量下降的情況得到了很大程度的恢復。同時，qPCR 分析表明，OTUB1-CKO 脛骨中 Osx 和 Ocn 等成骨標志物的表達減少在給予 FGFR2 后恢復正常。相反，破骨標志物凝血酶 K（Ctsk）的表達在 OTUB1-CKO 和 FGFR2 的作用下保持不變。這些結果表明，FGFR2 是 OTUB1-缺陷小鼠的成骨過程中不可或缺。
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圖4.FGFR2能挽救OTUB1缺失導致的骨量丟失和成骨缺陷
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5. 過表達OTUB1可減輕OVX小鼠的骨質疏松癥
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OTUB1 在成骨過程中的積極作用表明，它有可能通過上調成骨過程在骨質疏松癥中的應用?；诖?，研究人員通過卵巢切除術（OVX）建立了骨質疏松癥小鼠模型，發現來自OVX小鼠的 BMSCs 中的mRNA 水平明顯降低。此外，在老年骨組織中，OTUB1的mRNA水平也明顯降低。于是研究人員提出疑問:是否外源表達OTUB1能否緩解OVX小鼠體內的骨質疏松癥？作者將AAV9運載的OTUB1注射到OVX小鼠的膝關節中。手術兩個月后在 AAV9-OTUB1處理過的OVX小鼠的股骨中觀察到了GFP信號。OTUB1處理的OVX小鼠的脛骨最大載荷和剛度與OVX 組相比明顯恢復。同時，經AAV9-OTUB1處理的OVX小鼠的骨量也得到了顯著恢復，BMD、BV/TV和 Tb.N 均有所增加。此外，OVX小鼠脛骨中Osx和Ocn等成骨標志物的表達隨著 OTUB1過表達增加，而破骨標志物 Ctsk在OVX組和OTUB1處理的OVX組中表達相當。這些結果表明，在膝關節中過表達OTUB1通過促進骨生成緩解了OVX小鼠的骨質疏松癥。
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圖5.過表達OTUB1可減輕OVX小鼠的骨質疏松癥
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綜上，本研究證明了OTUB1在成骨中的關鍵作用。這篇文獻揭示了 OTUB1 與 Smurf1 之間的關系，通過特異性編輯 FGFR2 的泛素化來調控成骨。過度泛素化導致 FGFR2 蛋白水平降低，并損害下游信號傳導、 最終導致缺乏 Otub1 的小鼠出現骨質疏松癥。通過重新表達表皮生長因子受體 2 可部分緩解這種癥狀。此外，OTUB1 作為成骨的正向調節因子，在骨質疏松癥小鼠模型中防止骨質流失,通過卵巢切除術建立的骨質疏松癥小鼠模型。這篇文獻為 OTUB1 在成骨過程中的生理功能提供了新的見解，并表明針對成骨細胞的特異性OTUB1作為骨質疏松癥的一種潛在治療策略。
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該研究中AAV9-FGFR2、AAV9-OTUB1由吉凱基因提供。