腫瘤壞死因子(TNF)是少數可以進行靶向治療炎癥性疾病的細胞因子之一。然而，靶向TNF的靶向治療可能會引起顯著的副作用。更系統性地認識TNF功能及信號通路將為開發更有針對性的治療提供基礎。
蛋白組學領軍人物之一Matthias Mann教授團隊利用DIA磷酸化蛋白質組學技術解析了TNF介導的大量磷酸化事件，并利用DIA蛋白質組學和DIA磷酸化蛋白質組學揭示了CDK在TNF信號通路中的重要作用。研究成果以“Phosphoproteome profiling uncovers a key role for CDKs in TNF signaling”為題，發表在Nature Communications（中科院JCR一區，IF：14.919 ）上。
研究過程
在TNF刺激的5min內，參與囊泡融合和髓系細胞分化調控的蛋白的磷酸化狀態增加，而涉及RIG-I、NF-κB、TRIF和MYD88通路以及GTPase激活的條目則出現在15min之后。與轉錄相關的條目在整個時間過程中都受到調控，且在最近的時間點最為強烈，這與轉錄是TNF信號級聯的最下游過程相一致。Motif富集分析顯示了不同激酶沿時間過程的動態激活。CDK1/2和PLK1/3的磷酸化motif表達下調，而IKBKB(IKK2)和PRKAA1/2磷酸化motif在早期時間點表達上調。
研究者同時對其他細胞系在TNF處理15min后的磷酸化事件進行檢測，這些細胞系包括A549（腺癌肺泡基底上皮細胞系）、HT29（結直腸腺癌細胞系）和U2OS（骨肉瘤細胞系）和小鼠骨髓源性巨噬細胞(BMDMs)。許多在TNF處理下顯著調控的磷酸化事件在不同的人類細胞系中是共享的。
相比之下，抑制下游激酶如IKK1/2、p38、MEK1/2和JNK對TNF調控的磷酸化位點有些微到中等的影響。抑制p38的影響最強，降低了76%的TNF 上調的磷酸化位點。在STRING蛋白相互作用網絡中，TNF刺激下與其他磷酸化蛋白不相關的蛋白可以被劃為上游激酶。
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研究者從有無TAK1抑制劑的TNF處理15min的細胞中分離細胞膜、細胞核和細胞質，并進行了這些亞細胞組分的DIA蛋白質組學和DIA磷酸化蛋白質組檢測（未處理組、TNF處理和TNF+TAK1i處理組，各3種亞細胞組分，共9組，生物學重復均為n=4）。
在TNF刺激下，NF-κB必需調節因子(NEMO或IKBKG)、TRAF2和TNIP1水平在細胞膜中升高。其他一些蛋白質也易位到細胞膜部分。一些蛋白質在TNF處理后從細胞膜中脫離出來。在TNF刺激的15min內，觸發了許多參與轉錄的蛋白的核易位，表明存在轉錄反應。大多數激酶，包括TAK1(MAP3K7)、p38(MAPK14)、IKK2(IKBKB)和MEK1/2(MAP2K1/2)，主要富集于細胞質中，而不依賴于TNF的刺激。然而，TNF調控的這些激酶下游蛋白上的磷酸化位點在所有的細胞亞組分中都有富集。其中大部分依賴于定位在細胞質中的TAK1的活性，這意味著TNF觸發了激酶及其底物的蛋白易位。研究者甚至檢測到了蛋白質組學中未檢測到的肽段上的TNF調控的磷酸化事件。這表明這些底物的磷酸化作用觸發了易位，或者在易位時，蛋白質立即被磷酸化。
通過靶向TAK1和IKK2來抑制NF-κB信號通路，可誘導TNF下游的細胞死亡。這種細胞死亡可以是凋亡也可以是壞死。為了探索磷酸化事件調節細胞死亡的作用，研究者用TNF處理3h或與cIAP抑制劑 Smac mimetic（SM）聯用誘導U937細胞凋亡，或與Smac mimetic（SM）和caspase抑制劑Idun(IDN-6556)誘導細胞壞死，并進行DIA蛋白質組學和DIA磷酸化蛋白質組學檢測（未處理組、TNF處理組、TNF+SM組和TM+SM+IDN-6556組，共4組，每組生物學重復均為n=4）。研究者還在BMDM細胞中進行了實驗。研究者發現細胞凋亡過程中，兩種細胞類型中參與RNA剪接和mRNA加工的蛋白質上的磷酸位點顯著上調（U937細胞中344個磷酸位點，BMDMs中123個磷酸位點）。刺激誘導的磷酸化蛋白質組變化與蛋白質組的變化無關。磷酸化的激酶富集分析顯示了細胞凋亡過程中周期蛋白依賴性蛋白激酶（CDK）的調控。對刺激后CDKs上顯著變化的磷酸位點進行分析，發現是轉錄性的CDKs(CDK7、9、12、13和14)受到調控，而不是參與了細胞周期調控的CDKs。后續實驗表明TNF信號通路誘導細胞磷酸化，從而誘導CDK9和CDK12/13介導的RPB1的激活。
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TNF通過誘導廣泛的靶基因觸發強大的轉錄反應。其促炎特性主要是通過上調細胞因子來調節免疫反應，而促存活基因的上調則可以防止細胞過度死亡和炎癥。研究者的數據表明，RPB1磷酸化受到調控，由于該蛋白是TNF介導的轉錄所必需的，研究者想知道抑制轉錄性的CDKs是否會影響TNF誘導的靶基因表達。
CDK抑制劑處理的細胞的磷酸化蛋白質組學（TNF處理與否（共2組）和TNF±各CDK抑制劑組（共6組），共8組，每組生物學重復n=4）顯示，TNF誘導的CDK12/13磷酸化以及早期和晚期的RNA加工受到抑制。有趣的是，對TNF處理的U937細胞的蛋白質組學分析顯示，Dinaciclib（CDK1/2/5抑制劑）或兩種CDK12抑制劑CDK12-in345和THZ531幾乎完全消除了蛋白調控。這些CDK抑制劑也不同程度降低了經典靶基因ICAM1和SOD2的上調。CDK抑制消除了XIAP的輕微下調，這表明這種調控依賴于轉錄。NF-κB信號通路作為驅動TNF誘導轉錄的主要途徑則不受影響。為了驗證CDK抑制劑確實在轉錄水平上抑制了靶基因的表達，研究者檢測了它們對TNF介導的CCL2(MCP1)和CXCL10(IP10)mRNA水平上調的影響，這些基因的mRNA水平確實降低了。同樣，加入CDK抑制劑后，小鼠骨髓源性巨噬細胞(BMDMs)釋放的細胞因子IP10較少。這與之前研究CDK9作用的研究一致，這表明抑制轉錄性的CDKs9、12和13可能在疾病中具有抗炎作用。
研究者進一步想知道通過轉錄性CDK抑制劑抑制TNF介導的FLIP上調是否會增強TNF誘導的細胞死亡。用泛CDK抑制劑或其他不同CDK抑制劑處理細胞，均與TNF、TNF +Smac mimetic (SM)或SM +IDN-6556聯合一樣觸發協同細胞死亡。靶向不參與轉錄的CDKs的抑制劑未能誘導協同細胞死亡。這些實驗表明，轉錄性的，而不是非轉錄性的CDKs加劇了TNF誘導的細胞死亡。
為了檢測CDK抑制劑是否也增強了TNF依賴的壞死，研究者使用SM和caspase 抑制劑IDN-655652聯合處理U937細胞。在野生型U937細胞中，CDK抑制也增強了CDK12/13的壞死，而缺乏壞死介導因子MLKL和RIPK3的細胞未能死亡。協同誘導細胞凋亡并不局限于U937細胞，也存在于A549細胞、HT29細胞、U2OS細胞、小鼠皮膚成纖維細胞(MDFs)和小鼠BMDMs中。僅使用TNF并不足以誘導這些細胞的協同死亡，這表明抑制CDK只能增強而不能觸發細胞死亡。研究者的結論是，TNF介導的轉錄性的CDKs調控導致其底物的磷酸化和調控，包括RPB1的CTD。這個最大的RNA聚合酶II亞基對于FLIP等促存活蛋白的轉錄是必需的，其磷酸化對于防止細胞凋亡和壞死是必要的。不同細胞系中的細胞死亡數據表明，CDK抑制劑加重細胞死亡取決于它們對TNF介導的細胞凋亡和壞死的敏感性。
研究總結
本研究通過DIA磷酸化蛋白質組學深入分析了TNF刺激不同時間后誘導的下游磷酸化信號事件。通過亞細胞組分的DIA蛋白質組學和DIA磷酸化蛋白質組學揭示了磷酸化依賴性的蛋白質易位。對TNF誘導凋亡和壞死細胞的DIA磷酸化蛋白質組分析揭示了轉錄周期蛋白依賴性激酶（CDK）活性在促進細胞因子產生和防止TNF信號受體下游的細胞過度死亡方面的關鍵作用。
吉凱基因憑借多年在靶標篩選及驗證服務領域的技術積累，建立的標準化 、工程化 、系統化的GRP平臺，為中國研究型醫生提供科研服務，加快科研成果轉化。其中，多組學平臺包含蛋白質組學平臺和高通量測序平臺：
·蛋白質組學平臺擁有多臺timsTOF Pro、Exploris 480高精度質譜儀，專業的Spectronaut Plusar、Mascot等分析軟件，提供專業的4D、DIA、TMT、PRM、磷酸化修飾組、Olink蛋白質組等檢測服務，強大的機器學習算法、IPA分析、蛋白基因組分析服務，系統的生物標志物、分子分型、藥物靶點、基因功能研究等解決方案，真正讓廣大研究型醫生的科研工作更省心、更省力、更高效；
·高通量測序平臺分為常規測序服務和單細胞測序服務：單細胞測序擁有10x和BD兩個平臺，提供單細胞RNA-seq、單細胞核測序、單細胞混樣RNA-seq、單細胞TCR/BCR、單細胞（RNA+ATAC）、空間轉錄組測序等服務；常規測序服務提供meRIP-seq（m6A/m1A/m7G/m5C 等RNA甲基化修飾測序）、acRIP-seq（ac4C RNA乙?；揎棞y序）、ATAC-seq、Ribo-seq（翻譯組測序） 、mRNA/miRNA/LncRNA/circRNA-seq、全轉錄組測序（兩文庫/三文庫）、外泌體miRNA/LncRNA-seq、WGS/WES、WGBS、RRBS、BSAS等服務。
研究過程
1. DIA磷酸化蛋白質組學揭示TNF處理不同時間誘導的磷酸化事件
為了系統性揭示TNF下游磷酸化事件及動力學圖景，研究者用TNF處理髓系細胞系U937，時間為15秒到1小時(處理組和非處理組各10個時間梯度，共20組，生物學重復n=6)，并進行DIA 磷酸化蛋白組學檢測。共檢測到超過60000個磷酸化肽段，其中28000個肽段有高重復性（高可信）。TNF誘導的磷酸位點在15min達到峰值，但在處理3min后檢測到顯著的上調，且在60min時恢復到基線水平。許多這些瞬時磷酸化修飾蛋白參與了NF-κB和模式識別信號傳導，一小簇轉錄相關蛋白的磷酸化位點在TNF刺激后60min仍然保持上調。在TNF刺激的5min內，參與囊泡融合和髓系細胞分化調控的蛋白的磷酸化狀態增加，而涉及RIG-I、NF-κB、TRIF和MYD88通路以及GTPase激活的條目則出現在15min之后。與轉錄相關的條目在整個時間過程中都受到調控，且在最近的時間點最為強烈，這與轉錄是TNF信號級聯的最下游過程相一致。Motif富集分析顯示了不同激酶沿時間過程的動態激活。CDK1/2和PLK1/3的磷酸化motif表達下調，而IKBKB(IKK2)和PRKAA1/2磷酸化motif在早期時間點表達上調。
研究者同時對其他細胞系在TNF處理15min后的磷酸化事件進行檢測，這些細胞系包括A549（腺癌肺泡基底上皮細胞系）、HT29（結直腸腺癌細胞系）和U2OS（骨肉瘤細胞系）和小鼠骨髓源性巨噬細胞(BMDMs)。許多在TNF處理下顯著調控的磷酸化事件在不同的人類細胞系中是共享的。
2. 抑制激酶揭示了TNF刺激下激酶-底物的關系
由于在TNF刺激下許多下游激酶的同時激活，對特定的激酶-底物關系的識別仍然具有挑戰性。為了解決這個問題，研究者使用特定的抑制劑靶向關鍵激酶對細胞進行處理，并進行DIA磷酸化蛋白組學檢測（TNF處理與否（2組）和激酶抑制劑±TNF處理（10組），共12組，生物學重復n=4）。雖然單獨TNF就誘導了數百個磷酸化事件的調控，但抑制TAK1幾乎完全消除了這種作用。這證實了TAK1在TNF信號通路上游的作用。相比之下，抑制下游激酶如IKK1/2、p38、MEK1/2和JNK對TNF調控的磷酸化位點有些微到中等的影響。抑制p38的影響最強，降低了76%的TNF 上調的磷酸化位點。在STRING蛋白相互作用網絡中，TNF刺激下與其他磷酸化蛋白不相關的蛋白可以被劃為上游激酶。
3. 亞細胞組分的DIA蛋白組學和DIA磷酸化蛋白組學揭示TNF介導的磷酸化誘導了廣泛的蛋白質易位
研究者從有無TAK1抑制劑的TNF處理15min的細胞中分離細胞膜、細胞核和細胞質，并進行了這些亞細胞組分的DIA蛋白質組學和DIA磷酸化蛋白質組檢測（未處理組、TNF處理和TNF+TAK1i處理組，各3種亞細胞組分，共9組，生物學重復均為n=4）。
在TNF刺激下，NF-κB必需調節因子(NEMO或IKBKG)、TRAF2和TNIP1水平在細胞膜中升高。其他一些蛋白質也易位到細胞膜部分。一些蛋白質在TNF處理后從細胞膜中脫離出來。在TNF刺激的15min內，觸發了許多參與轉錄的蛋白的核易位，表明存在轉錄反應。大多數激酶，包括TAK1(MAP3K7)、p38(MAPK14)、IKK2(IKBKB)和MEK1/2(MAP2K1/2)，主要富集于細胞質中，而不依賴于TNF的刺激。然而，TNF調控的這些激酶下游蛋白上的磷酸化位點在所有的細胞亞組分中都有富集。其中大部分依賴于定位在細胞質中的TAK1的活性，這意味著TNF觸發了激酶及其底物的蛋白易位。研究者甚至檢測到了蛋白質組學中未檢測到的肽段上的TNF調控的磷酸化事件。這表明這些底物的磷酸化作用觸發了易位，或者在易位時，蛋白質立即被磷酸化。
4. TNF誘導的細胞死亡觸發了強烈的RNA加工反應和CDK激活
通過靶向TAK1和IKK2來抑制NF-κB信號通路，可誘導TNF下游的細胞死亡。這種細胞死亡可以是凋亡也可以是壞死。為了探索磷酸化事件調節細胞死亡的作用，研究者用TNF處理3h或與cIAP抑制劑 Smac mimetic（SM）聯用誘導U937細胞凋亡，或與Smac mimetic（SM）和caspase抑制劑Idun(IDN-6556)誘導細胞壞死，并進行DIA蛋白質組學和DIA磷酸化蛋白質組學檢測（未處理組、TNF處理組、TNF+SM組和TM+SM+IDN-6556組，共4組，每組生物學重復均為n=4）。研究者還在BMDM細胞中進行了實驗。研究者發現細胞凋亡過程中，兩種細胞類型中參與RNA剪接和mRNA加工的蛋白質上的磷酸位點顯著上調（U937細胞中344個磷酸位點，BMDMs中123個磷酸位點）。刺激誘導的磷酸化蛋白質組變化與蛋白質組的變化無關。磷酸化的激酶富集分析顯示了細胞凋亡過程中周期蛋白依賴性蛋白激酶（CDK）的調控。對刺激后CDKs上顯著變化的磷酸位點進行分析，發現是轉錄性的CDKs(CDK7、9、12、13和14)受到調控，而不是參與了細胞周期調控的CDKs。后續實驗表明TNF信號通路誘導細胞磷酸化，從而誘導CDK9和CDK12/13介導的RPB1的激活。
5. CDK激酶的活性是TNF靶基因轉錄所必需的
TNF通過誘導廣泛的靶基因觸發強大的轉錄反應。其促炎特性主要是通過上調細胞因子來調節免疫反應，而促存活基因的上調則可以防止細胞過度死亡和炎癥。研究者的數據表明，RPB1磷酸化受到調控，由于該蛋白是TNF介導的轉錄所必需的，研究者想知道抑制轉錄性的CDKs是否會影響TNF誘導的靶基因表達。
CDK抑制劑處理的細胞的磷酸化蛋白質組學（TNF處理與否（共2組）和TNF±各CDK抑制劑組（共6組），共8組，每組生物學重復n=4）顯示，TNF誘導的CDK12/13磷酸化以及早期和晚期的RNA加工受到抑制。有趣的是，對TNF處理的U937細胞的蛋白質組學分析顯示，Dinaciclib（CDK1/2/5抑制劑）或兩種CDK12抑制劑CDK12-in345和THZ531幾乎完全消除了蛋白調控。這些CDK抑制劑也不同程度降低了經典靶基因ICAM1和SOD2的上調。CDK抑制消除了XIAP的輕微下調，這表明這種調控依賴于轉錄。NF-κB信號通路作為驅動TNF誘導轉錄的主要途徑則不受影響。為了驗證CDK抑制劑確實在轉錄水平上抑制了靶基因的表達，研究者檢測了它們對TNF介導的CCL2(MCP1)和CXCL10(IP10)mRNA水平上調的影響，這些基因的mRNA水平確實降低了。同樣，加入CDK抑制劑后，小鼠骨髓源性巨噬細胞(BMDMs)釋放的細胞因子IP10較少。這與之前研究CDK9作用的研究一致，這表明抑制轉錄性的CDKs9、12和13可能在疾病中具有抗炎作用。
6. 轉錄性CDKs可抑制TNF誘導的細胞死亡
研究者進一步想知道通過轉錄性CDK抑制劑抑制TNF介導的FLIP上調是否會增強TNF誘導的細胞死亡。用泛CDK抑制劑或其他不同CDK抑制劑處理細胞，均與TNF、TNF +Smac mimetic (SM)或SM +IDN-6556聯合一樣觸發協同細胞死亡。靶向不參與轉錄的CDKs的抑制劑未能誘導協同細胞死亡。這些實驗表明，轉錄性的，而不是非轉錄性的CDKs加劇了TNF誘導的細胞死亡。
為了檢測CDK抑制劑是否也增強了TNF依賴的壞死，研究者使用SM和caspase 抑制劑IDN-655652聯合處理U937細胞。在野生型U937細胞中，CDK抑制也增強了CDK12/13的壞死，而缺乏壞死介導因子MLKL和RIPK3的細胞未能死亡。協同誘導細胞凋亡并不局限于U937細胞，也存在于A549細胞、HT29細胞、U2OS細胞、小鼠皮膚成纖維細胞(MDFs)和小鼠BMDMs中。僅使用TNF并不足以誘導這些細胞的協同死亡，這表明抑制CDK只能增強而不能觸發細胞死亡。研究者的結論是，TNF介導的轉錄性的CDKs調控導致其底物的磷酸化和調控，包括RPB1的CTD。這個最大的RNA聚合酶II亞基對于FLIP等促存活蛋白的轉錄是必需的，其磷酸化對于防止細胞凋亡和壞死是必要的。不同細胞系中的細胞死亡數據表明，CDK抑制劑加重細胞死亡取決于它們對TNF介導的細胞凋亡和壞死的敏感性。
研究總結
本研究通過DIA磷酸化蛋白質組學深入分析了TNF刺激不同時間后誘導的下游磷酸化信號事件。通過亞細胞組分的DIA蛋白質組學和DIA磷酸化蛋白質組學揭示了磷酸化依賴性的蛋白質易位。對TNF誘導凋亡和壞死細胞的DIA磷酸化蛋白質組分析揭示了轉錄周期蛋白依賴性激酶（CDK）活性在促進細胞因子產生和防止TNF信號受體下游的細胞過度死亡方面的關鍵作用。
吉凱基因憑借多年在靶標篩選及驗證服務領域的技術積累，建立的標準化 、工程化 、系統化的GRP平臺，為中國研究型醫生提供科研服務，加快科研成果轉化。其中，多組學平臺包含蛋白質組學平臺和高通量測序平臺：
·蛋白質組學平臺擁有多臺timsTOF Pro、Exploris 480高精度質譜儀，專業的Spectronaut Plusar、Mascot等分析軟件，提供專業的4D、DIA、TMT、PRM、磷酸化修飾組、Olink蛋白質組等檢測服務，強大的機器學習算法、IPA分析、蛋白基因組分析服務，系統的生物標志物、分子分型、藥物靶點、基因功能研究等解決方案，真正讓廣大研究型醫生的科研工作更省心、更省力、更高效；
·高通量測序平臺分為常規測序服務和單細胞測序服務：單細胞測序擁有10x和BD兩個平臺，提供單細胞RNA-seq、單細胞核測序、單細胞混樣RNA-seq、單細胞TCR/BCR、單細胞（RNA+ATAC）、空間轉錄組測序等服務；常規測序服務提供meRIP-seq（m6A/m1A/m7G/m5C 等RNA甲基化修飾測序）、acRIP-seq（ac4C RNA乙?；揎棞y序）、ATAC-seq、Ribo-seq（翻譯組測序） 、mRNA/miRNA/LncRNA/circRNA-seq、全轉錄組測序（兩文庫/三文庫）、外泌體miRNA/LncRNA-seq、WGS/WES、WGBS、RRBS、BSAS等服務。