近期，小編接觸到很多老師咨詢腸道方向的AAV的注射方式，本期我們將對腸道的病毒感染方式及AAV參考劑量進行總結(jié)。
首先，我們了解一下腸道系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)，小腸全長約4-6米，分為十二指腸、空腸和回腸三部分；上連胃幽門，下接盲腸隨后連接大腸（包括盲腸含闌尾、升結(jié)腸、結(jié)腸右曲、橫結(jié)腸、結(jié)腸左區(qū)、降結(jié)腸、乙狀結(jié)腸、直腸）。
常見感染腸道的注射方式主要分為4種，分別為尾靜脈注射、腹腔注射、灌腸和腸系膜動脈注射[1，2]。其中系統(tǒng)性的遞送途徑包括尾靜脈注射和腹腔注射，這兩種注射方式操作簡單，但不具有特異性，除了腸道其他組織器官也有可能感染，同時病毒的損耗也會比較大：
一、 尾靜脈注射
尾靜脈注射是常見的的系統(tǒng)性注射方式，通過這種方式可以感染全身的大多數(shù)器官，它的優(yōu)點是操作簡便，對動物的損傷較小，缺點是無法實現(xiàn)特異性感染，尤其是肝臟、血管等更易感。
具體步驟如下（來源于吉凱平臺）：
尾靜脈注射示意圖（圖片來源于吉凱）
1. 實驗前準(zhǔn)備
準(zhǔn)備內(nèi)容：小鼠、小鼠固定器 ( 或 50ml 離心管）、1ml 注射器、酒精棉球、病毒 ( 冰浴融化）、生理鹽水或 PBS。
2. 小鼠固定
a. 首先提取小鼠尾巴，將其放在鼠籠蓋或手臂上，并進行適當(dāng)安撫；
b. 然后將小鼠裝入固定器 ( 可用 50ml 離心管改造）中，蓋緊蓋子，并使其尾巴朝外露出；
c. 用酒精棉球擦拭小鼠尾巴，使其血管擴張 ( 也可用熱水、加熱器等）。
3. 病毒注射
a. 用生理鹽水或 PBS 將病毒稀釋至合適滴度 ( 控制病毒注射體積在100-200μl）；
b. 用 1ml 注射器吸取 100~200μl 病毒；
c. 將小鼠尾巴拉直使其紅色靜脈清晰可見，在距尾尖 1/3 處進針，緩慢注入病毒后拔出，用棉球按壓注射點 1min 左右以止血。
4. 動物恢復(fù)
將小鼠從固定器上取下，放回原飼養(yǎng)籠中。
二、腹腔注射
腹腔注射的方式適用于脂肪、肌肉、胰腺、腸道等全身器官，以及新生鼠（造成的損傷較小），通過這種遞送途徑，腸道的平滑肌及漿膜感染概率更大，可以觀測到散在的GFP染色，但是上皮細(xì)胞感染的概率較小。
具體步驟如下（來源于吉凱平臺）：
腹腔注射示意圖（圖片來源于吉凱）
1. 實驗前準(zhǔn)備
準(zhǔn)備內(nèi)容：小鼠、病毒液 ( 冰浴融化）、1ml 注射器。
吸取病毒：用 1ml 注射器吸取適量病毒，置于冰上備用。
2. 小鼠固定
a. 首先提取小鼠尾巴，將其放在鼠籠蓋或手臂上，并進行適當(dāng)安撫；
b. 然后左手握小鼠，用拇指和食指捏住小鼠頸背部，用無名指及小指固定其尾和后肢，確保小鼠軀體舒展且不能亂動。
3. 病毒注射
a. 右手取吸好病毒的注射器，翻轉(zhuǎn)左手使小鼠頭部朝下且腹部完全暴露給操作者；
b. 手持注射器在下腹部離腹白線約 0.5cm 處下針，使針頭與小鼠腹部約成 30°夾角刺入腹部，刺入過程中如感覺到抵抗力突然消失，表明針頭已進入腹腔，此時調(diào)整針頭方向約與小鼠腹部平行，緩緩進針；
c. 針頭進入適當(dāng)距離后，勻速注射病毒液后，緩緩拔出針頭 ( 旋轉(zhuǎn)針頭以避免漏液）。
4. 動物復(fù)蘇
將小鼠放回原飼養(yǎng)籠中，注意觀察小鼠狀態(tài)。
除了系統(tǒng)性的遞送方式外也可通過局部注射的方式實現(xiàn)AAV的遞送，腸道方向包括灌腸和腸系膜動脈注射的方式，優(yōu)點是病毒劑量更小、可以直接感染需求部位，但同時也具備一定的缺點，那就是對動物造成的損傷更大。
三、灌腸
有文獻報道通過灌腸的方式感染腸道組織，由于需要通過小鼠肛門插管進行灌腸，因此感染深度具有一定的局限性，感染結(jié)腸的概率更大，一般小鼠劑量推薦4E10vg/只以上，體積200μl。
具體步驟如下（來源于參考文獻[1,3,4]）：
1. 實驗前準(zhǔn)備
準(zhǔn)備內(nèi)容：小鼠、病毒液 ( 冰浴融化）、聚乙xi導(dǎo)管。
吸取病毒：用 1ml 注射器吸取適量病毒，置于冰上備用。
2. 病毒注射
a．首先使用異氟醚麻醉小鼠；
b．然后將聚乙xi軟管插入距離離肛門4厘米深的小鼠結(jié)腸部位，使用注射器緩慢注入適量的病毒；
c．注射完畢后，將小鼠在垂直倒立狀態(tài)保持1分鐘以上，以確保病毒在結(jié)腸部位的均勻分布；
d. 待小鼠復(fù)蘇后可以恢復(fù)正常飲水及飲食。
四、腸系膜動脈注射
腸系膜動脈是分布于消化管的動脈，主要分為腸系膜上動脈和腸系膜下動脈，結(jié)合小腸結(jié)構(gòu)圖來看，腸系膜上動脈分布于小腸左側(cè)，腸系膜下動脈分布于結(jié)腸、大腸及泄殖腔部位，因此通過該方法可以感染小腸及結(jié)腸部位的細(xì)胞。
具體方法如下（來源于參考文獻[1,2,5]）：
a. 保定完成后使用異氟醚麻醉小鼠；
b. 通過左上方的皮膚進行1-2 cm的穿刺沿著腋線和側(cè)腹的脾臟區(qū)域。切開腹外斜肌暴露SMA（腸系膜動脈）。使用微型牽開器將皮膚和腹壁固定，并用溫暖的鹽水紗布覆蓋小腸防止回縮；
c. 使用微血管放大器在放大20倍的情況下，將SMA輕輕地從腹膜后剝離，在近端傷口周圍放置連接注射針，使用一個微型血管鉗暫時夾閉血管腹主動脈；
d. 將定制33號1/2‘’英寸點式2型進樣針（Hamilton; Reno, NV)）連接250 μl漢密爾頓TLL氣密性進樣針注射器插入腸系膜動脈，輕輕結(jié)扎血管保持穩(wěn)定防止注射泄漏，隨后進行病毒注射；
e. 注射結(jié)束后取下注射器械，解除夾閉，使血液流回腸道組織。
腸系膜動脈注射示意圖
最后，小編對腸道系統(tǒng)的AAV注射方法及劑量進行總結(jié)，大家可以根據(jù)自己需求進行選擇預(yù)實驗的參考劑量，設(shè)置梯度，選擇最佳劑量：
腸道系統(tǒng)AAV感染范圍及劑量參考
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