納米顆粒介導(dǎo)功能大分子的遞送是治療人體疾病的有效方法。而外泌體作為細(xì)胞間信息交流的天然納米載體，可以包裹大分子蛋白質(zhì)和化學(xué)藥物等遞送給靶細(xì)胞，被廣泛用于醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域。
化學(xué)藥物和核酸分子很容易被裝載到外泌體囊腔中，但是外泌體對蛋白的裝載始終存在一些阻礙，比如蛋白的提純難度高、易變性以及在靶細(xì)胞中折疊率低等問題大大降低了轉(zhuǎn)運率。為了解決這些限制，EXPLOR技術(shù)被開發(fā)、應(yīng)用到外泌體轉(zhuǎn)運中，它主要利用光遺傳學(xué)控制的可逆蛋白-蛋白相互作用，結(jié)合外泌體的自身形成過程，從而實現(xiàn)內(nèi)源性蛋白到外泌體中的自動裝載1。這樣既省去了蛋白提存成本，又在很大程度上提高了遞送效率。
一、EXPLOR技術(shù)原理
EXPLOR技術(shù)示意圖2
要想構(gòu)建EXPLOR系統(tǒng)，首先需要在產(chǎn)生外泌體的細(xì)胞內(nèi)引入兩個融合蛋白，融合蛋白Ι由一個外泌體特異性標(biāo)志基因(CD9、CD63或CD81)和第一光特異性蛋白基因（如CIBN）組成，融合蛋白ΙΙ由目的裝載蛋白和與第一光蛋白特異結(jié)合的第二光蛋白（如CRY2）組成，經(jīng)過460-490nm藍(lán)光照射后，CIBN與CRY2相互結(jié)合，從而拉著蛋白到囊泡表面，融合質(zhì)膜，分泌外泌體，此時的目的蛋白在外泌體內(nèi)是非游離形式。
當(dāng)去除光照后，CIBN與CRY2蛋白發(fā)生分離，目的蛋白將以游離的方式存在于外泌體囊腔內(nèi)，這時可以分離、純化得到載有目的蛋白的外泌體，外泌體繼續(xù)通過膜融合、胞吞過程，將裝載蛋白運送給靶細(xì)胞。除了CIBN-CRY2光蛋白組合外，在600-650nm光照下PhyB可以結(jié)合PIF蛋白，在460-490nm光照下GIGANTEA可以結(jié)合FKF1蛋白3，這些組合蛋白同樣可以用到EXPLOR系統(tǒng)中。
二、EXPLOR應(yīng)用
EXPLOR技術(shù)在外泌體中的應(yīng)用為醫(yī)學(xué)研究提供了新的制藥平臺，同時也為各種功能蛋白到靶細(xì)胞的轉(zhuǎn)運提供了有力的工具。
如利用EXPLOR將治療膿毒癥的超阻遏物IκB裝載到外泌體中，以外泌體作為治療載體，遞送IκB到待治療的靶細(xì)胞內(nèi)，檢測發(fā)現(xiàn)EXPLOR-外泌體的遞送能有效提高IκB對核NF-κB活化的抑制效率，降低促炎因子的表達(dá)和嗜中性粒細(xì)胞群壽命的延長，從而改善膿毒癥患者的器官損傷，提高整體生存率4。
外泌體結(jié)合EXPLOR技術(shù)在功能性蛋白（如Cre重組酶）的遞送方面也有很大的應(yīng)用潛力。Cre重組酶主要在細(xì)胞核中表達(dá)，實驗中經(jīng)過藍(lán)光照射后，Cre-mCherry-CRY2蛋白可以易位到質(zhì)膜部分2，為了避免cre不必要的核定位，當(dāng)Cre-mCherry-CRY2蛋白轉(zhuǎn)染細(xì)胞后立即使用藍(lán)光照射，通過增強光蛋白Cre-mCherry-CRY2與CIBN-EGFP-CD9間的相互作用，提高外泌體對Cre蛋白的裝載率。
細(xì)胞內(nèi)Cre-mCherry表達(dá)
為了檢測EXPLOR系統(tǒng)裝載的cre重組酶在體外細(xì)胞間的遞送效率，從loxP-STOP-loxP-EGFP轉(zhuǎn)基因小鼠中分離出分化神經(jīng)元進(jìn)行細(xì)胞實驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)95%的細(xì)胞都能表達(dá)EGFP。同時進(jìn)行了小鼠體內(nèi)cre遞送率的研究，將cre-EXPLOR外泌體注射到pCAG-loxP-STOP-loxP-eNpHR3.0-EYFP轉(zhuǎn)基因小鼠大腦腹外側(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)EYFP在腦腹外側(cè)附近有明顯表達(dá)。可見，外泌體結(jié)合EXPLOR技術(shù)在體內(nèi)外分子的遞送中有很大應(yīng)用前景。
EXPLOR介導(dǎo)Cre重組酶的體內(nèi)外遞送
EXPLOR介導(dǎo)外泌體遞送的系統(tǒng)不僅操作成本低，無需分離、純化目的蛋白，而且也不會產(chǎn)生蛋白錯誤折疊的問題。僅僅通過外泌體的形成過程和光源照射，就能裝載并運送大分子功能蛋白到特定細(xì)胞內(nèi)，這種方式為外泌體蛋白療法提供了顯著優(yōu)勢。
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參考文獻(xiàn)…
1. 外泌體之家. EXPLORs—一種通過光可逆蛋白相互作用促使蛋白質(zhì)裝載入外泌體的新方式
2. Nambin Yim et al. Exosome engineering for efficient intracellular delivery of soluble proteins using optically reversible protein–protein interaction module. Nature Communications. 2016; 7 : 12277
3. 崔哲熙等. 包含負(fù)載蛋白的外泌體的組合物以及制備和遞送該組合物的方法. 2018
4. Hojun Choi, Youngeun Kim, Amin Mirzaaghasi. et al. Exosome-based delivery of super-repressor IkBa relieves sepsis-associated organ damage and mortality. Sci. Adv. 2020; 6 : eaaz6980