蛋白間相互作用是細胞各種基本功能的主要完成者，參與幾乎所有的重要生命活動。因此，蛋白-蛋白相互作用研究以及建立相互作用的關系網絡圖，具有十分重要的意義，也是目前蛋白質研究領域的熱點。
親和純化結合SWATH（AP-SWATH）技術是近幾年發展起來的研究蛋白相互作用的一種重要技術，該技術能夠高特異性的準確富集到靶蛋白的特異性相互作用蛋白，并實現復合蛋白質的準確鑒定和定量。
下面就來818如何通過AP-SWATH技術來開展蛋白互作研究之旅！
基本信息
題目：Precise Temporal Profiling of Signaling Complexes in Primary Cells Using SWATH Mass Spectrometry（利用SWATH質譜技術研究原代細胞信號復合體的精確時間圖譜）
期刊：Cell Reports
影響因子：8.281
主要技術：AP-SWATH
研究背景
信號通路中蛋白質-蛋白質相互作用的動態組織過程是協調細胞功能以響應外在和內在信號的關鍵。親和純化聯合質譜技術（AP-MS）一直是各種模型系統中研究蛋白質-蛋白質相互作用鑒定和蛋白質復合物鑒定的方法。生長因子受體結合蛋白2（GRB2）是由1個SH2結構域和2個SH3結構域構成的必需接頭蛋白，其參與調節MAPK信號通路。在T淋巴細胞中，GRB2也是TCR信號通路網絡中的一部分，其不僅能夠調控T細胞的發育，而且能促成成熟T細胞的活化。鑒于GRB2在信號啟動和多樣化中的重要作用，在不同的信號級聯和細胞類型中形成的信號復合體的組成和動力學是理解其實際功能范圍的關鍵。因此，作者選擇GRB2作為評估swath- ms的模型，可以在兩種原始細胞中快速、可靠、準確地定量分析蛋白質相互作用動力學（圖1）
研究內容及結果
1. 繪制外周CD4 + T細胞中GRB2的相互作用圖譜
作者利用AP-SWATH鑒定了在TCR介導的原代小鼠T細胞激活之前或之后與GRB2相互作用的蛋白質。經分析，獲得658 個蛋白（FDR<1％），其中53個是具有高可信度的GRB2相互作用蛋白（圖2）。
2. 外周CD4 + T細胞中GRB2的蛋白質相互作用組的可重復定量測定
從原代細胞產生高度精確和可重復的AP-SWATH數據對于理解生理層面的動態復合物形成至關重要。本文作者評估了AP-SWATH分析技術的重現性，以量化TCR介導的T細胞活化0.5min，2min，5min和10min后GRB2蛋白相互作用組的動力學變化。AP-SWATH的目標分析數據是由之前鑒定的604個肽段和4020 GRB2特異轉換體和53個高可信度的GRB2相互作用因子組成。這53個蛋白質在整個時間序列中同時進行量化（圖3A）, 例如，在T細胞刺激前后，在所有四個生物重復中，中值系數變異（CV）范圍為19.7％~33.2％，與使用轉化細胞系進行的AP-SWATH研究計算得到的CV值相似（圖3C）。值得注意的是，使用30分鐘的短液相色譜（LC）梯度對于高度可重現和準確的定量不會產生影響，從而能夠提高時間效應實驗的通量。因此，可以通過原代小鼠CD4 + T細胞來實現高可信度、高時間分辨的GRB2蛋白相互作用蛋白的鑒定和定量。
3. 對外周CD4+ T細胞中時間分辨GRB2蛋白相互作用的透徹分析
作者利用兩個開源軟件系統分析了AP-SWATH數據：用于原始數據分析的Skyline中的圖形用戶界面MSstats和用于進一步數據處理和可視化的Garuda平臺，這兩個系統都都支持統計學和計算分析的重現性。利用這些軟件工具，生成了熱圖、蛋白質簇和統計數據，證明了在T細胞激活的最初幾秒內，GRB2周圍形成了復雜的蛋白質組合（圖3A，3B）。
4. 發育中的T細胞和成熟T細胞的GRB2相互作用蛋白存在特定的動力學差異
作者接下來測定了抗CD3和抗CD4抗體活化后的發育中的T細胞和成熟T細胞之間的GRB2相互作用蛋白動力學，觀察其是否存在差異。在構成GRB2相互作用的蛋白質中，在發育和成熟T細胞中能同時檢測到14個GRB2相互作用因子，因此可用于整個動力學的比較分析（圖4）。結果發現，在14個GRB2相互作用因子中，有6個在發育和成熟T細胞之間觀察到相似的時間分辨特征(LAT，GRAP，MPCP，PRC2A，SHC1，和THMS1)（圖4）。相反，ARAP1、GRAP2、M4K1、PTPRA、SATB1、SHIP1、SOS1、USB3A在發育和成熟T細胞間至少有一個刺激時間點之間存在顯著的動力學差異（圖4）。
文章小結
蛋白質-蛋白質相互作用的特異性和動態形成是調節細胞信號傳導的關鍵機制。然而在公共蛋白相互作用數據的基礎上，正確建立能夠反映原代細胞信號系統的通路模型，受系統檢索蛋白相互作用數據的方法缺陷影響。該文章引入了AP-SWATH的工作流程來克服這些缺點。文中的結論可以證明所提出的方法具有足夠的精確性和穩定性，以準確地探測信號復合物的形成。另外，本文介紹的方法流程可以廣泛地應用于各種細胞和組織類型的蛋白相互作用關系的鑒定。
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小編告訴您，金開瑞借助高精度質譜平臺，結合親和純化與Label-free、SILAC或SWATH定量技術，開發了一系列靈活的互作蛋白質組研究策略。目前熱門的AP-SWATH流程，靈敏度高、重復性好，非常適合蛋白質相互作用的研究。