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PCR該如何選擇合適的DNA聚合酶？

聚合酶鏈式反應(Polymerase Chain Reaction, PCR)是分子生物學研究的核心技術，決定PCR反應成敗的關鍵因素則是DNA聚合酶，它是PCR反應的核心成分。目前市場上的DNA聚合酶種類繁多，常見的有：Taq，Canace，Pfu，KOD，Phusion，Klenow、Bst、Phi29、Primerstar、Tth等。那么，什么樣的片段該選擇什么樣的DNA聚合酶呢？

【一】選擇PCR酶的關鍵因素：

1、熱穩定性：DNA聚合酶能夠耐受高溫的能力，不同的DNA聚合酶的熱穩定性差異較大，一般通過半衰期體現。

2、保真度：DNA聚合酶精確復制DNA模板的能力。部分DNA聚合酶具有3’-5’的核酸外切酶活性，能夠校正錯誤堿基，保真度可通過錯配率體現。

3、靈敏度：DNA聚合酶對低拷貝模板的擴增能力，可通過檢出率體現。

4、特異性：DNA聚合酶在PCR過程中只擴增目的片段的能力，常通過抗體法或配體法等方式對DNA聚合酶進行修飾提升酶特異性。

5、擴增速度：DNA聚合酶向DNA新鏈中摻入核苷酸的速率，高擴增速率DNA聚合酶可加快整體實驗時間。

（圖片來源：DNA Replication-The Definitive Guide/Biology Dictionary）

【二】常用的DNA聚合酶及其應用：

① Taq DNA聚合酶：應用于常規PCR

Taq DNA聚合酶來源于Thermus aquaticus，熱穩定性及擴增效率高，擴增速度為30-60 sec/kb，缺乏3’→5’核酸外切酶活性，無校正功能，易產生錯配堿基。使用該酶擴增得到的PCR產物3’末端帶A尾，可直接用于TA克隆。

② 高保真DNA聚合酶：應用于高保真PCR，如基因克隆、點突變、測序及SNP分析等

高保真DNA聚合酶是一類具有3’→5’核酸外切酶活性的酶，具有校正功能，擴增產物為平末端。當實驗對保真度要求較高時，需選擇此類酶。常見的高保真酶有Pfu、KOD、Phusion、Canace等。不同的高保真酶在保真度，擴增速度，擴增效率等方面有所差異。

翌圣生物Hieff Canace? Plus High-Fidelity DNA Polymerase（Cat#10153ES）基于Pfu DNA聚合酶改造而成，其保真性是Taq酶的83倍，Pfu酶的9倍，擴增速度高達10 sec/kb，擴增目的片段長達13 kb，具有極強的擴增效率和廣泛的模板適應性，非常適合復雜模板的高保真擴增。

圖2. 翌圣10153ES Hieff Canace?高保真DNA聚合酶的保真性是Taq酶的83倍，pfu酶的9倍（測序法）。

③ 熱啟動DNA聚合酶：應用于高特異性PCR擴增，可在室溫條件下配制反應體系

熱啟動DNA聚合酶是一類提高PCR反應特異性及靈敏度的酶。該類酶是通過抗體法或配體法等方式對DNA聚合酶進行修飾而成，使得DNA聚合酶活性在預變性溫度下才被激活，可抑制低溫條件下由引物的非特異性退火或引物二聚體引起的非特異性擴增。

翌圣生物Hieff Union? Hotstart High Specific Taq DNA Polymerase（Cat#10726ES）是利用雙抗體進行雙封閉的熱啟動DNA聚合酶，在預變性溫度下加熱30 sec封閉抗體即可完全失活，釋放出DNA聚合酶活性和核酸外切酶活性，能有效防止錯配或引物二聚體引起的非特異性擴增，抑制探針降解產生的熒光信號下降。

圖3. 雙封閉抗體可有效封閉Taq DNA聚合酶的外切酶活性。

圖4. 與T公司抗體封閉Taq 酶對比，翌圣雙封閉抗體Taq酶（10726ES）在ARMS-PCR擴增中分型準確，靈敏度更高。

④ 等溫擴增DNA聚合酶：應用于等溫擴增技術，如LAMP、CPA、RCA等

等溫擴增DNA聚合酶是一類具有較強熱穩定性、鏈置換活性及5’→3’聚合酶活性的酶，能在恒溫條件下快速、高效、特異性的擴增模板，無需PCR熱變性擴增循環。

翌圣生物升級Bst Ⅱ Plus DNA Polymerase（Cat#14402ES）具有5′→3′DNA 聚合酶活性及強鏈置換能力。與野生型相比，該酶的靈敏度、擴增效率、穩定性等方面均有大幅提高，同時增加了dUTP耐受性，可廣泛應用于基于等溫擴增技術。

圖5. 與同類國外競品N及國內競品T對比，翌圣14402ES的靈敏度明顯優于國內外競品。

【三】產品選擇指南

注：以上所有的酶都有高濃度或無甘油版形式，詳情咨詢18186211438。