iTRAQ技術是目前比較成熟且常用的定量蛋白質組學技術，在尋找疾病蛋白質biomarkers的研究中經常用到該技術。尋找蛋白質biomarkers的研究經常分為兩部分：一為通過差異定量的方法高通量篩選，并利用生物信息學的手段縮小候選驗證的范圍；二為利用各種驗證手段對前期高通量篩選的結果進行驗證，篩選出最具有潛力的候選biomarkers，以供更進一步地臨床分析。
本篇文獻里作者先是采用基于質譜的高通量定量蛋白質組學技術——iTRAQ，篩選出與結腸癌診斷相關的biomarkers，接著分別通過免疫組化、QPCR、多例病例的數據集等研究對篩選的候選蛋白質biomarkers進行驗證，最終認為LOXL2是最具有潛力的診斷標志物。
文獻來源：LOXL2 is highly expressed in cancer-associated fibroblasts and associates to poor colon cancer survival. Clin Cancer Res. 2015 Jul 23. pii: clincanres.3096.2014.
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對結腸癌發展不同階段的正確區分（尤其是II期和III期），迫切需要尋找到足夠多的診斷標志物。腫瘤相關的成纖維細胞（CAFs）是腫瘤微環境的主要參與者，與腫瘤的復發和存活密切相關。作者利用蛋白質組學技術（iTRAQ）分析了從腫瘤病人組織中分離純化出的結腸癌相關成纖維細胞（CAFs）與正常成纖維細胞（NFs）的蛋白表達差異，發現大量間質相關蛋白可能作為診斷標志物。其中LOXL2和TAGLN表現出很強的診斷價值，LOXL2的高表達與較差的預后直接相關，并能夠很好地指針高風險的II期和III期病人。LOXL2可能在臨床應用中具有很好的風險評估潛力，有利于判斷后續治療策略及改善最終的預后。
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收集12對結腸癌病人的腫瘤組織及癌旁組織，將腫瘤相關成纖維細胞（CAFs）與正常成纖維細胞（NFs）進行純化分離，利用4-Plex iTRAQ對成纖維細胞的細胞上清和胞內蛋白進行差異蛋白質組學分析。差異表達的間質相關蛋白隨后進一步利用免疫組化進行驗證。預后診斷潛力評價過程中，① 外源基因表達數據集（共包含超過300例病人的數據）被用于進行訓練和風險界定，② 70例病例組織的PCR結果以及 ③ 121例病例組織的免疫組化結果被用于進行驗證。整合的數據集被用于對II期和III期病人進行風險預測。
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iTRAQ workflow used for the proteomic analysis of CAFs and NFs.
CM: Cell Conditioned Medium WCE: Whole Cell Extract
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iTRAQ分別鑒定到1780個胞內和305個細胞上清蛋白，其中分別有57 和43蛋白具有表達差異，作者選擇了其中15個差異表達蛋白進行了WB和PCR驗證。體外培養的成纖維細胞經TGF-β刺激后，表現出了相似的蛋白表達譜。
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Proteins identified and quantified in both iTRAQ replicates. About 78% of identified proteins and 82% of quantified proteins were coincident in both analyses.
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Figure 1. Validation of CAFs deregulated proteins. (A) Whole cellular extracts or concentrated protein samples from conditioned medium of CAFs and NFs were separated on SDS-PAGE gels, transferred to nitrocellulose membranes and probed with the indicated antibodies. Tubulin was used as a loading control. Protein abundance was quantified by densitometry to compare the expression with the iTRAQ ratios. (B) cDNAs synthesized from total RNA obtained from NFs and CAFs were subjected to QRT-PCR using specific primers for the selected genes and 18S rRNA for normalization. BJh-TERT cells were starved in serum-free medium, treated with TGFβ (5 ng/mL) for 24 h and lysed. The extracts were analyzed by QPCR (C) and Western blot (D) using specific primers and the indicated antibodies. Data represent the mean ± SD of three experiments. (*, p < 0.05, **, p < 0.01; ***, p < 0.001).
（以下幾段均為通過不同方法對iTRAQ結果中篩選的差異蛋白進行驗證）
為了分析這些差異表達蛋白的細胞表達特異性，作者采用了GSE39396 dataset（從6個結腸癌病人分離得到的4種細胞endothelial cells: CD31+, epithelial cells: EPCAM+, inflammatory cells: CD45+ and CAFs: FAP+）進行了初步分析，發現其中60個上調表達蛋白中的28個蛋白，以及40個下調表達蛋白中的24個蛋白，與成纖維細胞的高表基因狀態一致。
接下來，作者用QPCR的方法分析了這些蛋白在KM12C、KM12SM、SW480 和SW620上皮結腸癌細胞系中的基因表達，發現其中的10個蛋白特異性地或者過表達于成纖維細胞中。
免疫組化試驗進一步證實，ACAN、αSMA、CDH13、DKK3、TAGLN、TGM2和LOXL2均選擇性表達于結腸癌間質中，而在上皮或正常的結腸黏膜中不表達或無規律性表達。這些結果說明，篩選出的蛋白具有作為特異性腫瘤間質標志物的價值。
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為了評估這些蛋白是否能夠指針疾病的復發風險和預后，作者首先在一個由70例結腸癌病人組成的隊列中進行了驗證。腫瘤組織中的LOXL2表達水平比正常組織高出44%，LOXL2的高表達與整體存活（P = 0.001 HR: 8.52 (1.90-38.29)）和高復發率（P = 0.001 HR: 5.38 (1.70-17.01)）一致。
多變量統計分析數據集的結果證實，LOXL2的表達水平與較差的預后相關，并可作為一個獨立的無疾病存活和整體存活的預后因子（Table 1）。
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隨后，另外一批121個結腸癌病人的免疫組化結果進一步證實，大約32%的病人表現出較強的LOXL2表達（>50%的陽性標記），間質細胞核的陽性標記與無疾病存活和整體存活有關。將LOXL2和其他標志物進行組合診斷，并不能明顯提高診斷能力。
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為了評價LOXL2對II期和III期病人的風險評估價值，作者采用多個數據集分析了II期病人的復發率與表達水平的關系。結果發現，LOXL2高表達的II期病人的復發周期更短（P value = 0.011 HR: 2.74 (1.22-6.20)），其三年DFS為73.9%，而低表達組為89.6%。高表達LOXL2的47例II期和III期病人的無病期更短。55個II期病人的免疫組化結果顯示，其無病期為P= 0.005 HR: 4.35 (1.43-13.25)。LOXL2高表達也與III期病人的整體存活（P = 0.004 HR: 3.40 (1.40-8.24)）有關。
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通過蛋白質組學的篩選和后續驗證，該研究證實LOXL2的表達水平與結腸癌的預后有關，并可通過區分II期和III期階段為后續的治療決策提供幫助。
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