X-Gluc--轉基因植物常用GUS顯色底物
Gus基因（β-glucuronidase，β-D-葡萄糖苷酸酶）是從大腸桿菌中分離出來的，其編碼的β-葡萄糖苷酸酶是一種水解酶，能催化許多β-葡萄糖苷酯類物質的水解。絕大多數植物細胞內是不存在內源的GUS活性，因此Gus基因廣泛用作轉基因植物的報告基因，尤其廣泛應用于研究外源基因瞬時表達的轉化實驗。此外，Gus基因3’端與其他結構形式的融合基因也能夠正常表達，所產生的融合蛋白仍具有GUS活性，這對研究外源基因表達的具體細胞部位提供了方便條件，也是它相對于其他報告基因的一個優點。
圖1 X-Gluc分子結構式(CAS NO.114162-64-0)
X-Gluc(5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl-beta-D-glucuronide)可作為GUS的顯色底物。在適宜條件下，GUS可催化底物X-Gluc分解，反應分為兩步：首先是切割葡糖醛酸部分產生無色吲哚氧基中間產物，隨后吲哚氧基中間產物被氧化成藍色不溶5,5’-二溴-4,4’-二氯，借此用來觀察轉基因植物中外源基因的表達情況，鑒定轉基因植株。
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GUS活性檢測（組織化學染色）
1、配制X-Gluc儲存液(20 mg/mL)
用1.5 mL DMF溶解30 mg X-Gluc粉末，終濃度為20 mg/mL。渦旋混勻，用鋁箔包好，分裝，于-20℃儲存，一年內有效（注：若失效后，溶液則會變成亮紅色）。
2、取材
將葉片、花瓣、根莖等組織剪成小片，放于1.5 mL離心管中于4%多聚甲醛（新鮮配置）固定30 min，然后用磷酸鹽溶液或檸檬酸鹽溶液潤洗。
注：用于染色的植物材料的制備方法要因涉及的特定組織和器官的不同而異。例如，擬南芥的根、花和葉片以及煙草幼苗的根就可以不作任何預處理而直接染色。但是像煙草和馬鈴薯這些植物的莖和葉就必須在染色前切成薄片(1-3mm)。當操作大的組織和樣品時，可以選用真空滲入法來幫助底物滲入細胞。
3、染色
加入稀釋后配制好的GUS染色工作液(1 mg/mL)至完全覆蓋材料，25-37°C孵育1h至過夜，有明顯藍色出現。注意要做陰性和陽性對照實驗。
4、洗脫
將材料轉入70%乙醇或80%丙酮中脫色2-3次，至陰性對照材料為白色。GUS染色陽性的藍色斑點很穩定，在酒精中不褪色。
5、觀察
一般染色后，GUS染色陽性的藍色斑點肉眼就能看到。但是有些材料可能藍色斑點很細微，要在顯微鏡下才能看到。
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10905ES |