大腦由數百萬個神經元細胞組成，了解這些神經元如何連接在一起可以更好地解析大腦的工作方式。為了更容易區分大腦中的單個神經元，通常需要一種特殊標記方法，隨機標記一小部分神經元以突出它們的樹突和軸突精細結構以及走向，稱為稀疏標記。今天，我們盤點下幾種常用的基于熒光成像的神經稀疏標記方法。
一、多色標記系統
隨機多色標記方法“Brainbow”是一種可以用不同熒光蛋白對多個神經元進行差異標記，但該系統熒光亮度不足，Sakaguchi等人基于此系統，引入四環素誘導系統，稱為“Tetbow”，成功增強了熒光強度，實現對神經元的標記：
是不是亮度還不夠？作者進一步使用SeeDB2 作為組織清除劑，減少甘油 (SeeDB2G) 或油 (SeeDB2S) 浸沒物鏡的球面像差，提高3D高分辨率成像。將Tetbow系統質粒通過電穿孔引入大腦皮層的第 2/3 層神經元，樹突棘的詳細結構，軸突，神經元形態的精細細節都清晰地可視化
通過將不同熒光的載體混合共同注射腦部，實現不同細胞染上不同的熒光，以區分不同的神經元，再以四環素系統調整不同神經元的亮度，以實現明暗的標記對比，可以預見的是，混合的熒光類型越多，可能稀疏標記程度越高。
二、基于化學標簽的成像
組織的透明度與對熒光蛋白的損傷之間存在權衡，水性組織清除劑可用于熒光蛋白的大規模三維成像。然而，要徹底清除富含脂質的有髓軸突，必須使用清潔劑、溶劑和加熱等苛刻的清除處理方法，大多數基于溶劑的清除方法會導致熒光蛋白的淬滅。為了克服這個問題，作者開發出來基于SNAP、Halo、CLIP 和 TMP等化學標簽的標記系統Tetbow，這些標簽分子量相對較小，易于滲透到厚組織中。一旦它們與其底物形成共價鍵，并與合成標簽一起發出熒光，即使在苛刻的透明條件下，熒光也能保持穩定。
化學標簽在苛刻的清除條件下是穩定的，意味著可以有更廣泛的清除方法選擇，特別是對于富含脂質的厚組織。其次，與熒光蛋白相比，化學標簽可以提供更多的熒光光譜和光化學特性選擇。例如，合成熒光團覆蓋了從紫外到近紅外范圍的光譜，在成像時擴大了可能的光譜范圍。
三、基于MORF的稀疏成像
DNA 微衛星，如基因組中的單核苷酸重復序列，在 DNA 復制或修復過程中容易受到隨機移碼突變的影響。通過構建CRE依賴的熒光報告系統，在翻譯起始密碼子ATG與熒光蛋白之間，插入重復的堿基C，在 Cre +在細胞后代中，floxed內的轉錄終止序列被移除，但由于單核苷酸重復作為框架外的“翻譯開關”，大多數細胞仍然無法翻譯 MORF 報告蛋白，只有單核苷酸重復是3的倍數，膜結合報告蛋白才會被翻譯以標記細胞形態
基于上述原理，作者構建了單核苷酸重復移碼 (MORF) 作為隨機平移開關賦予 Cre 依賴稀疏細胞標記的四個小鼠品系，以及引入四環素表達的改造型TIGRE-MORF，兩者都能實現神經元的稀疏標記和隨機表達：
該系統利用重復堿基復制時，會隨機缺失作為熒光表達的開關，將熒光定位于細胞膜以標記更清楚的神經元形態，只需將報告系統做成小鼠，即可配合不同神經元啟動子表達的CRE病毒或者CRE鼠雜交，即可實現不同神經元的形態標記。對于需要研究多種神經類型標記的需求，無需注射多種病毒，就能開展后續研究。
四、多AAV標記系統
羅敏敏/龔輝合作，開發了基于四環素、CRE/loxp、FLP/frt三者合一的AAV遞送系統。該系統的原理是:FLP重組酶受CRE酶的誘導特異性表達，稱為控制子；FLP又特異性調控GFP和rTA的表達,其中，GFP是報告系統，rTA是四環素系統的調控蛋白，其表達之后可以激活兩大系統TRE啟動子的表達。該系統的亮點是，不需要額外加四環素開啟系統表達，而是利用TRE本身的泄露表達，自行刺激第二個病毒GFP的表達，形成正向表達反饋，因此成為放大子。
作者利用雙病毒共同注射多巴胺啟動子控制的CRE鼠VTA區，三周后取腦部切片，獲取了十五個多巴胺神經元的投射圖：
該系統也可以對單個神經元進行標記，利用retro血清型（不跨突觸的逆行標記）對軸突遞送CRE重組酶，將 AAV-retro-Cre 病毒注射到背側紋狀體中，雙 AAV 病毒混合到皮層區域，只有同時感染上三種病毒的才得以標記，在C57BL/6 中稀疏標記了九個皮質紋狀體神經元的投射老鼠，并繪制了九個神經元的網絡圖。
與前幾種同樣使用四環素系統的方法不同，該系統無需給小鼠補充誘導劑，而是利用系統本身的泄露機制實現對部分神經元的標記，與多色標記相比，有更高的分辨率。
稀疏標記的核心設計原理是實現對部分神經細胞的隨機標記，而鄰近細胞不標記，因此，多采取四環素系統以控制熒光表達強度，再配合本文所列的其他控制系統（多病毒競爭感染、重復堿基開關、重組酶系統）形成部分細胞熒光重新的高分辨率，當然，后期的組織樣本處理也至關重要。本文重點簡述稀疏標記的病毒及動物模型設計原理，各有優劣，需要考慮自身實驗需求及條件選取標記系統。
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