重組腺相關病毒（rAAV）以低免疫原、非整合、廣泛組織靶向性而成為有前景的動物實驗手段及基因治療平臺。目前，AAV廣泛用于小鼠、猴子等模式生物的轉基因研究以及臨床試驗，包含阿爾茨海默氏病、關節炎、脂蛋白脂肪酶（LPL）缺乏、帕金森氏病、肌肉營養不良和惡性腫瘤等眾多疾病^【1】。

但天然的rAAV基因組為單鏈DNA（ssDNA），必須依靠細胞復制因子來合成互補鏈，此步驟是rAAV載體表達效率及開始表達時間的限制因素^【2】。

經過ITR改造，自互補AAV（scAAV，即雙鏈AAV）繞過了第二鏈合成的限速步驟，除了提升載體遞送效率之外，還可增加體內外轉基因表達的強度、縮短開始表達時間，以及具有更高的體內DNA穩定性和更有效的環化作用，低劑量scAAV即可實現高劑量ssAAV的表達效果，可以有效降低動物實驗的成本，尤其是以豬、猴子等大型動物為研究對象的實驗^【3】。

圖1. ssAAV及scAAV結構圖

在以下研究中，作者對比了單鏈ssAAV和雙鏈scAAV在體內的表達情況。首先，構建了CMV驅動的促紅細胞生成素基因（mEpo）ssAAV，以及對應的二聚體形式scAAV，分別注射2E+10病毒至小鼠門靜脈，并以7天為間隔檢測mEpo的表達，結果如圖2所示：scAAV表達周期比ssAAV提前一周，且表達水平顯著高于ssAAV^【4】。

圖2. mEpo表達示意圖

基于以上研究成果，吉凱基因研發人員開發出了scAAV載體，利用CMV-Luc報告系統檢測，結果表明無論在細胞水平還是在體水平scAAV的轉導效率更高、表達時間更快。具體結果如下：

1. 細胞水平

以相同劑量梯度的ssAAV和scAAV感染293T細胞，于72小時檢測熒光素酶活性，結果如圖3所示：scAAV轉導效率較常規ssAAV提升1.5-2倍。

圖3. ssAAV和scAAV感染293T細胞效率對比

2. 動物水平

以ssAAV以及scAAV為載體將螢火蟲熒光素酶報告系統遞送至小鼠體內，通過尾靜脈注射總量為1E+11的病毒并在多個時間點檢測肝臟表達情況。結果如圖5所示scAAV組熒光素酶表達顯著快于ssAAV組，并且注射后相同時間點scAAV組熒光素酶表達水平顯著高于ssAAV組。

圖4. scAAV及ssAAV 在小鼠體內不同時間點表達效果檢測

在基因治療研究領域，病毒轉染效率低、病毒滴度有限等問題制約著基因治療的發展。而scAAV則有望克服以往難題，推動基因治療領域的發展^【8、9】。目前已有相關研究表明scAAV用于基因治療的可行性。小編以三篇文章為例簡述：

一、青光眼的基因治療

將單劑量的scAAV.GFP注射到大鼠和食蟹猴眼中。通過熒光，免疫組化和無創性淋巴鏡檢查來評估GFP的表達。直至注射后27天，在注射AAV的大鼠的前節組織上均未觀察到GFP轉導。相比之下，scAAV可以非常有效地轉導小梁網，起效快（4天）。眼睛保持清澈，未觀察到不良反應。如圖5、6所示：轉基因表達在大鼠中持續> 3.5個月，在猴子中持續> 2.35年^【5】。

圖5. 大鼠眼部注射scAAV2.GFP后不同時間點GFP表達檢測

圖6. 猴子眼部注射scAAV2.GFP后不同時間點GFP表達檢測

在大鼠和猴子的小梁網中scAAV病毒載體提供更長時間且安全的轉導，因此其可被開發為小梁網藥物用于青光眼的基因治療。

二、角膜移植

角膜內皮細胞（CEC）在角膜后表面形成一個單層，與視力密切相關。他們的泵功能是角膜基質消融以維持角膜透明所必須的。因為其是單層細胞所以每個細胞都與培養基直接接觸。而且其沒有血管和免疫能力，降低了免疫反應的風險。此外在移植前其在體外培養一到四周，因此給予了開發基因治療的可能。然而使用ssAAV需要極高的病毒滴度以保證基因的表達，而scAAV的出現有望解決這一難題。

該研究表明，在大多數情況下，scAAV載體僅需要一半用量即可達到與ssAAV相等或更高的基因表達率。在人類供體角膜中，同樣用量的scAAV可達到感染并在64.7±11.3％的細胞中表達GFP，而SSAAV僅可在38.0±8.6％的細胞中表達（p <0.001）。此外，scAAV轉導的細胞可保持活力并顯示規則的形態^【6】。

圖7. 不同滴度的ssAAV2和scAAV2感染HCEC12細胞兩天后效果檢測

三、遞送含有結構的基因

研究發現scAAV更適合遞送shRNA等含有結構的基因。如圖8所示，研究人員發現使用ssAAV載體構建shRNA會產生較多的截短和有缺陷的AAV基因組，從而降低產量。而scAAV由于不存在第二鏈的合成，不受序列結構影響，從而實現高效穩定地表達^【7】。

圖8. ssAAV、scAAV基因組復制模型及短發夾DNA截斷示意圖

scAAV遞送如shRNA這樣含有結構的遺傳物質，可以有效降低截斷型無效aav基因組，提升了病毒基因組穩定性及表達效率，為基因治療提供了可靠的遞送方式。經過大量測試，除在極化的氣道上皮細胞與慢性淋巴細胞性白血?。˙-CLL）細胞中scAAV載體轉導效率較之ssAAV未有明顯改善外，在嚙齒類動物、犬類和非人類靈長類動物模型中，均發現scAAV的轉導效率較之ssAAV顯著提高^【8】。

綜上，scAAV因其表達快、感染效率高、作用時間久且免疫原性低等特征，使得在使用ssAAV遇到問題時有了更有效的替代工具。尤其是在臨床試驗中，scAAV使得基因治療前景更加光明。然而因為scAAV載體容量僅為ssAAV載體的一半，這一定程度上限制了scAAV的應用，不過我們相信隨著技術的發展，科學家們終會開發出更加突破性的遞送介質。

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