環狀RNA（CircRNA）是真核生物中具有組織特異性和細胞特異性表達模式的共價封閉內源性生物分子，其生物發生受特定的順式作用元件和反式作用因子調節。
到目前為止，CircRNA被報道與人類多種疾病相關，包括糖尿病、神經系統疾病、心血管疾病等。以發表于《Nature Reviews Genetics》的一篇綜述“The biogenesis, biology and characterization of circular RNAs”為例，小編今天為大家詳細介紹circRNA的生成、功能以及GOF和LOF的研究方法。
一、CircRNA的生成
CircRNA由稱為“反向剪接”的非經典剪接事件產生。在反向剪接中，下游剪接供體位點與上游剪接受體位點共價連接。盡管反向剪接被認為是可變剪切的一種，但它與線性可變剪接具有不同的分子機制。
大多數CircRNA從已知的蛋白質編碼基因表達，并且由單個外顯子或多個外顯子組成，比如circBase 中的絕大多數circRNA都只是由線性RNA的外顯子組成。
CircRNA的產生目前有以下三種機制：
1. 反向剪接（direct backsplicing）：外顯子來源的CircRNAs通過反向剪接的特殊剪接方式產生，在反向剪接過程中，下游剪接供體位點與上游剪接受體位點共價連接，形成磷酸二酯鍵產生一個環狀的RNA分子。外顯子來源的CircRNAs的產生強烈依賴具有長反向末端重復或結合RBPs的內含子兩種機制中的至少一種。這兩種機制都讓CircRNAs側翼的內含子緊緊挨在一起。這主要通過反向重復元件（例如Alu元件）之間的堿基對、RBPs的二聚體或RBPs與側翼內含子中的特定基序結合是下游剪接供體位點與上游剪接受體位點接近。這就是通常所說的內含子配對驅動環化和蛋白驅動的外顯子環化，詳見下圖a；
2. 外顯子跳讀形成套索結構驅動環狀RNA分子的形成，詳見上圖b左；
3. 在剪接過程中從分支結構脫離的內含子形成套索結構也能夠驅動環狀RNA分子的形成，詳見上圖b右；
二、CircRNA的功能
目前認可度比較高的CircRNA生物學功能主要包括環狀RNA作為microRNA sponge、單個環狀RNA調控蛋白結合、環狀RNA與蛋白相互作用及其編碼功能。
1. CircRNA作為microRNA sponge
這篇文章中，鑒定出的ciRS-7含有超過70個mir-7的結合位點，通過AGO2蛋白實現競爭性吸附miR-7進行調控靶基因表達水平。這一作用機制被稱為競爭性內源RNA（ceRNA）機制。
2. CircRNA作為sponge調控蛋白結合
這篇文章中提到的circMbl，具有mbl和MBNL1的結合位點。當mbl高表達時，會促進circMbl的生成而抑制線性轉錄本的表達，并且circMbl會與過量的mbl結合，使其含量趨于穩定。因此，可能存在一種自動調節回路，其中過量的mbl或MBNL1通過促進circRNA生物發生而降低了其自身mRNA的產生，而circRNA通過結合mbl或MBNL1來促進基因的線性剪接。
3. 調控基因轉錄
circRNA與RNA聚合酶Ⅱ相互作用并調節轉錄，或者EIcircRNA可與小核糖核蛋白互作用，再與RNA聚合酶Ⅱ結合。
4. 編碼功能
circRNA雖然屬于非編碼RNA，但也有部分circRNA可被核糖體翻譯并編碼多肽，進而行使調控功能。
三、GOF和LOF研究方法
1. GOF(過表達)構建策略
根據外顯子環化原理，構建環狀RNA過表達載體，研究側翼內含子序列，蛋白因子對環化的促進或者抑制作用。
同樣看這篇文章，該文章中列舉了幾種環狀RNA的構建方法，每種方法都可以成環，只是表達倍數不同。
上圖b構建了三種質粒，其中ciRS-7-fs由沒有側翼序列和剪接位點的ciRS-7外顯子組成；ciRS-7-ir包括剪接位點和內源側翼基因組序列【上游1 kb（kb），下游200 bp（bp）】。在ciRS-7中，上游序列的一部分被反向插入下游，如方向條所示。幾種構建方法最終的ciRS-7的表達豐度有所不同。
2. LOF（RNAi）構建策略
功能喪失研究對于了解任何circRNA的功能和生物學相關性非常關鍵，并且通常涉及RNAi。靶向circRNA backsplicing junction的siRNA通常高效且對circRNA具有特異性，盡管使用化學修飾的siRNA（例如鎖核酸RNA）可以提高敲減效率或降低脫靶作用。為了驗證circRNA的功能，可以使用RNAi干擾技術來有效沉默或抑制circRNA的表達，將RNAi靶點設計在backsplicing junction位置，可使用化學合成siRNA或者構建shRNA來達到功能喪失的目的。
在這里，簡單介紹下circRNA的敲除策略，大多數circRNA均來自蛋白質編碼宿主基因，這使circRNA特異性敲除變得復雜。如果已知對circRNA生物發生很重要的側翼內含子基序，則從基因組中刪除這些元素可以消除或減少circRNA表達，同時不會改變宿主基因的穩態RNA水平，此時可以考慮使用敲除策略。但是，使用這種方法的前提是需要事先了解circRNA的生物發生，并仔細驗證宿主基因的表達是否發生改變。
四、circRNA的檢測
在進行GOF或者LOF之后，需要驗證過表達和敲減情況，通常需要設計Divergent引物進行檢測。
五、結 語
circRNA在生物學和病理生物學中很重要，circRNA的研究可以給我們帶來很多令人驚訝的發現。盡管大多數RNA序列尚未通過其他技術驗證或進行功能研究，但目前已通過RNA-seq鑒定出了數千種不同組織和疾病中的circRNA。通過學習借鑒文章“The biogenesis, biology and characterization of circular RNAs”中描述的技術，將有助于我們對RNA-seq數據進行有效驗證，并幫助我們發現circRNA生物學研究的新方向。