將兩個蛋白或者多肽以肽鍵進行連接，表達出的蛋白即融合蛋白。融合蛋白的概念在細胞生物學研究以及大分子藥物研究領域有著重要的應用。
常見的融合蛋白包括，目的蛋白融合標簽蛋白，融合熒光蛋白，以及兩個不同蛋白的融合。那么這些融合蛋白的具體作用是什么呢，又有哪些需要注意的點呢？
｜融合標簽蛋白｜
在目的蛋白上融合一段小的標簽是目前常見的構建方案，我們先逐一介紹這種構建的優勢。
■ A. 便于使用wb和免疫熒光檢測外源基因的表達
對于一些基因，尤其是本底表達非常低的蛋白，在過表達之后，我們一般僅需要通過wb或者免疫熒光確認其表達即可。在融合標簽蛋白后我們僅需要使用標簽蛋白的抗體進行檢測即可。
如此有兩個主要優勢：其一，不同的目的蛋白均可以融合相同的標簽蛋白，因此實驗室只需要準備一種標簽蛋白的抗體即可檢測多個蛋白，節省很多的實驗經費。其二，有相當部分蛋白沒有商業化抗體或者抗體特異性不好，會導致后續結果非常難看，而標簽抗體是目前非常成熟的抗體，可以極大地避免出現該問題。
■ B.用于Co-IP或者ChIP實驗
為了檢測目的蛋白和另外一個蛋白有相互作用，一般我們會通過Co-[LS1] IP實驗來驗證。但是對于部分蛋白，并沒有商業化的抗體，或者已有的抗體特異性很差。此時，可以通過在目的蛋白上融合一個標簽蛋白，利用標簽蛋白來進行IP實驗。類似的，很多的ChIP實驗也可以采用相同的策略，因為ChIP級別的抗體相對也是較少的。常用的標簽包括flag，HA，his，myc，V5等，分子量大小都在1-2kd以內。
因此標簽是我們尋找蛋白相互作用結構域或者功能域的重要工具。常規的，我們將一個蛋白按照結構分成N端，C端和中心區域core（圖1）。例如，蛋白A和另外一個蛋白B有相互作用，為了確定蛋白A的哪個結構域參與了該相互作用過程，可以按照圖1構建蛋白A的不同截短體，通過Co-IP分析不同截斷體和蛋白B的相互作用來確定。
比如后續實驗全長和N端以及ΔC端能夠拉下來蛋白B，其它截短體不行，就說明是N端的結構域參與了這個結合過程。由于這些不同的截斷體的抗原表位沒有同源區，只能使用標簽抗體來進行IP實驗。
■ C. 蛋白純化
除了上面介紹的標簽，還有一類用于做蛋白純化的標簽，主要包括GST和his。GST標簽大小26kd左右，可以提高重組蛋白的穩定性，在絕大多數情況下，GST標簽蛋白是完全可溶的。GST標簽蛋白可以在溫和、非變形的條件下洗脫，因此保留了蛋白的抗原性和生物活性。
如果要去除GST標簽，可以在GST和目的蛋白中間添加特異性蛋白酶切位點，通過相應的蛋白酶切除GST。但由于GST標簽較大，有可能對融合蛋白的結構或者功能造成影響。相比GST標簽，his標簽的分子量非常小，不到1kd，蛋白純化完之后可以不需切除此標簽，也很少對蛋白產生功能影響。
圖 1 截短體構建
不管是用于wb，IP或者是蛋白純化，在構建標簽的時候，需要考慮標簽添加的位置，即N端或者C端。N端有信號肽的蛋白，由于在蛋白轉運后，信號肽（signal peptide）將被切除（圖2），所以這類蛋白我們一般將標簽構建在C端，或者構建在N端信號肽之后。N端有甲硫氨酸切除的蛋白一般也采用這種構建方式，如組蛋白H3（圖3）。另外，部分蛋白還存在前體肽（propeptide），在成熟后也將被切除（圖4），所以構建標簽時也要避免構建到被切除的肽段上。可以在uniprotKB數據庫查詢自己構建的蛋白是否包含信號肽或者前體肽，或者切除甲硫氨酸。
圖 2 信號肽
圖 3 首位移除甲硫氨酸
圖 4 前體肽
｜融合熒光蛋白｜
第一， 不確定目的蛋白的細胞定位，通過融合熒光蛋白進行確認；
第二， 用于確認某個結構域或者修飾位點是否影響目的蛋白定位；例如，構建野生型蛋白融合熒光蛋白后觀察蛋白定位于細胞核；同時構建缺失某個結構域或者突變某個修飾位點的突變蛋白融合熒光蛋白，觀察其蛋白定位是否發生變化；
第三， 觀察某個干預過程是否導致影響蛋白定位發生變化，例如調控其他基因表達，或者小分子化合物處理等。
除此以外，熒光蛋白融合目的基因的構建方式還可以用于區分內源蛋白和外源蛋白達量，因為GFP大小在26kd左右。過表達融合蛋白后，使用目的蛋白的抗體進行wb，一般可以雜出兩條明顯的條帶，通過對比條帶的亮度，可以區分內外源的表達比例。而如果使用前面介紹的各種標簽，由于其分子量很小，分子量在50kd上的蛋白一般就很難跑出兩條條帶。
熒光蛋白在融合目的基因時也需要考慮是融合在N端或者C端，具體考慮內容和標簽蛋白融合時一致。
對于融合熒光蛋白，建議在構建時在目的基因和熒光蛋白中間添加連接肽linker[LS1] ，吉凱基因在構建這類蛋白時一般會添加柔性連接肽，具體內容見后續內容介紹。同時，部分融合熒光蛋白可能出現融合后熒光極弱甚至沒有熒光的情況，這可能是融合蛋白內部相互作用影響了熒光蛋白的正確構象，此時可以考慮更換熒光蛋白的位置，如從N端換到C端。還可以考慮更換不同的連接肽序列，尤其是是剛性連接肽進行嘗試。
｜連接肽linker的選擇｜
原則上講，所有融合蛋白在構建的時候，都可以添加linker連接肽。通過研究天然的、具有多個結構域的蛋白，研究者發現了天然連接肽的多種特性。在該基礎上，研究者設計了多種人工的連接肽，分成兩大類，分別是柔性連接肽（flexible linker）和剛性連接肽（rigid linker）。
柔性連接肽用于連接需要有一定活動性和相互作用的兩個蛋白或者多肽（圖5）。柔性連接肽通常包含小的氨基酸，非極性的如Gly，極性的如Ser和Thr。這些尺寸更小的氨基酸提供了連接肽的靈活性，允許被連接的兩個蛋白具有一定的活動性。并且，添加Ser和Thr可以使得連接肽和水分子形成氫鍵，賦予連接肽在水溶液中的穩定性，從而減少連接肽和前后兩個蛋白的相互作用。
目前最主要的柔性連接肽由Gly和Ser殘基組成（“GS”linker）。其中使用最廣泛的柔性連接肽的序列為（Gly-Gly-Gly-Gly-Ser）n。通過調整n的數值（重復數），該GS連接肽的長度可以得到改變，從而可以最優地分離兩個兩個連接的蛋白，或使其可以相互作用。除了GS柔性連接肽以外，還有一些其它的柔性連接肽，如KESGSVSSEQLAQFRSLD，EGKSSGSGSESKST，(Gly)8，GSAGSAAGSGEF等。
雖然柔性連接肽具有很多的優點，但是顯而易見的，缺乏剛性是其一個很大的限制。有文章報導了柔性連接肽導致融合蛋白表達下降或者生物活性喪失。這很可能是由于柔性連接肽不能將兩個蛋白充分地分離，導致其產生了相互作用，進而影響融合蛋白的穩定性或者生物活性。在這種條件下，剛性連接肽，可以被用于完全隔絕兩個連接的蛋白，維持他們獨立的功能（圖5）。
Figure 5 剛性連接肽和柔性連接肽發揮功能示意圖
α螺旋結構肽段內部會形成氫鍵和緊密的結構，因此同時具有穩定性和剛性。利用（EAAAK）n形成成的α螺旋的剛性連接肽被廣泛應用于許多融合蛋白的構建?？梢钥吹胶芏鄤傂赃B接肽都采用了α螺旋，典型的如A（EAAAK）nA，或者（H4）2連接肽（A(EAAAK)4ALEA(EAAAK)4A）。
除了α螺旋外，還有一類剛性連接肽是富含Pro的氨基酸序列，Pro可以賦予連接肽極強的構象約束。序列為（XP）n，X可以是任意氨基酸，優先選擇Ala，Lys，Glu。需要注意的是，如果兩個連接的蛋白需要一定的相互作用的話，不建議使用剛性連接肽。并且，可能存在部分特例，兩個蛋白并不需要相互作用，但使用柔性連接肽的表達效果優于剛性連接肽的情況。其具體的原因可能還需要進一步地探究。
通過今天的介紹，大家是否對融合蛋白有了更多的認識呢？如果大家有相關產品的需求，歡迎聯系吉凱基因進行交流或者訂購！
更多精彩好文請掃碼關注病毒實驗幫